何文姬　孫幫燕　張　楨*．昆明市兒童醫(yī)院心臟功能科，云南　昆明　65008．昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/昆明市兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，云南　昆明　65008

超高效液相法測(cè)定卡馬西平和苯妥英鈉血藥濃度及其臨床應(yīng)用

何文姬1孫幫燕2張楨2*
1．昆明市兒童醫(yī)院心臟功能科，云南昆明650028
2．昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/昆明市兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650028

【摘要】目的:在兒科臨床上建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定癲癇患兒血漿中卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)和苯妥英鈉(Phenytoin，PT)濃度超高液相(Ultra performance liquid chromatography，UPLC)方法，并觀察藥物濃度與不良反應(yīng)。方法:收集癲癇患兒的超聲肝臟檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查資料。UPLC方法:取患兒血漿200μl，加入乙酸乙酯1.0 ml，渦旋1 min，室溫高速離心7 min(12 000×g)，取上清液700 μl吹干后，100 μl甲醇復(fù)溶進(jìn)樣分析;色譜條件為BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm; Waters公司)，0.3 ml·min－1的流速，甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55，v/v)，30℃的柱溫，2 μl的進(jìn)樣量，254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果:血漿中CBZ和PT色譜峰分離良好，無(wú)干擾，曲線為y =39589x +15280，R2=0.9991(CBZ); y =3739.5x +3073.5，R2= 0.9996(PT)，回收率均在90%～117%;超聲檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查顯示正常，無(wú)造血及消化系統(tǒng)不良反應(yīng)。結(jié)論:本法操作簡(jiǎn)便，適用于臨床工作中，患兒血漿的CBZ、PT濃度快速監(jiān)測(cè)。

【關(guān)鍵詞】卡馬西平;苯妥英鈉; UPLC;血藥濃度

通讀作者:張楨

癲癇是中國(guó)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥，也是一種由多種原因引起的慢性、反復(fù)發(fā)作神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，藥物控制仍是當(dāng)前主要的治療手段[1]。CBZ是一種優(yōu)秀的抗癲癇藥物; PT是治療癲癇大發(fā)作和局限性發(fā)作的首選藥物。但由于二者具有自身誘導(dǎo)作用，體內(nèi)處置過(guò)程復(fù)雜，治療劑量范圍窄(CBZ和PT有效濃度范圍分別為4～12和10～20μg/mL)，療效及毒性與血藥濃度關(guān)系密切，且患者間個(gè)體差異很大，長(zhǎng)期服用不良反應(yīng)較多，易產(chǎn)生耐藥性，因此對(duì)其體內(nèi)血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)十分必要[2]。監(jiān)測(cè)方法有高效液相法、熒光偏免疫法及酶增強(qiáng)免疫法。免疫法操作簡(jiǎn)單，但試劑價(jià)格昂貴，專一性差。HPLC準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可同時(shí)測(cè)定多種藥物及其代謝產(chǎn)物[3]。本文建立了UPLC法測(cè)定CBZ和PT血藥濃度方法，并調(diào)查統(tǒng)計(jì)其在兒科臨床應(yīng)用情況，觀察藥物對(duì)兒童是否產(chǎn)生不良反應(yīng)。

1　UPLC法測(cè)定藥物濃度含量方法建立

1.1儀器、試劑和色譜條件

1.1.1儀器、試劑Waters－ACQUITY－UPLC超高效液相色譜儀(Waters，美國(guó)); Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng); Sartorius BT125D電子天平(德國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司); MULTIFUGE X1R超高速離心機(jī)(Thermo公司，美國(guó)); XW－80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠); CBZ對(duì)照品(美國(guó)sigma公司，批號(hào): 344360050); PT(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào): 100138－200603);甲醇:色譜純(美國(guó)Fisher公司);水:自制超純水(水機(jī)，英國(guó)PURELAB ELGA公司)。

1.1.2色譜條件色譜柱為BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm; Waters公司);流速為0.3 ml·min－1;流動(dòng)相為甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55，v/v);柱溫為30℃;進(jìn)樣量: 2 μl;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2樣品測(cè)定

1.2.1儲(chǔ)備液的配制取CBZ對(duì)照品2.5 mg和PT5.0 mg，精密稱定，置5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為500(CBZ)和1000(PT)mg·L－1的儲(chǔ)備液。

1.2.2血樣預(yù)處理取血漿200μl，加入乙酸乙酯1.0 ml，渦旋1 min，高速離心7 min(12000×g)，取上清液700 μl，吹干后，100 μl甲醇復(fù)溶，2μl進(jìn)樣分析。

1.3線性關(guān)系和線性范圍取空白血漿160 μl共10份，分別加入40 μl不同濃度CBZ和PT，配成濃度為0.5、2.5、5、10、20、40μg/ml和1、5、10、20、40、80μg/mL溶液，按“3.2血樣預(yù)處理”操作，以濃度與峰面積作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(CBZ為y = 39589x + 15280，R2= 0.9991; PT為y =3739.5x +3073.5，R2=0.9996)。CBZ在0.5～40μg/ml濃度線性關(guān)系良好，PT在1～40μg/ml線性關(guān)系良好。CBZ和PT最低檢出限分別為0.1、0.21μg/ml。

1.4方法專屬性CBZ和PT色譜峰不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，見(jiàn)圖1－2。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)“3.2”處理后濃度為8μg/ml CBZ(保留時(shí)間為3.940min)和6μg/ml PT(保留時(shí)間為3.328min)色譜圖。

1.5回收率實(shí)驗(yàn)標(biāo)本加入0.5～2倍標(biāo)準(zhǔn)品后，按3.2處理，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)與正常兒童參考值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見(jiàn)表2。

表1　方法回收率統(tǒng)計(jì)表

表2　實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)與正常兒童參考值比較(±s)

表2　實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)與正常兒童參考值比較(±s)

CBZ正常組　CBZ小于有效濃度下限組CBZ大于有效上限組　PT正常組　PT小于有效濃度下限組PT大于有效上限組正常兒童參考值總膽紅素(μmol/mL)　10.7±2.5　11.0±2.0　12.2±1.5　10.1±2.1　11.0±2.3　12.2±1.5　3.4～17.7直接膽紅素(μmol/mL)　2.0±0.5　1.7±0.4　1.5±0.27　2.1±0.4　1.9±0.45　1.6±0.3　0～3.4血小板(109/L)　217±70　202±60　230±50　217±71　202±62　230±55　100～300白細(xì)胞數(shù)(109/L)　7.0±1.5　6.2±1.7　6.2±1.7　5.3±0.9　6.5±1.7　6.7±2.3　4～10

1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.6.1儲(chǔ)備液穩(wěn)定性考察儲(chǔ)備液4℃冷藏保存，分別在1、3、5、7、60d后，配制標(biāo)準(zhǔn)使用液4、50μg/ml直接進(jìn)樣測(cè)定，峰面積RSD低于7%，表明儲(chǔ)備液至少在60d穩(wěn)定。

1.6.2血樣穩(wěn)定性考察分別配制高中低濃度的標(biāo)本，－20℃冷凍保存，分別在0、12、24、36h測(cè)定，峰面積RSD均低于10%。

2　臨床應(yīng)用與結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.1標(biāo)本收集收集昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(昆明市兒童醫(yī)院)2011.4～2013.4癲癇患兒1667例癲癇患兒，有150例服用CBZ(包括與丙戊酸聯(lián)合用藥31例)，PT為37例?；純貉帩舛冗_(dá)穩(wěn)態(tài)濃度后，采集樣本，按3.2測(cè)定。

2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。收集白細(xì)胞數(shù)、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、和膽紅素[2]數(shù)據(jù)，部分結(jié)果以(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3結(jié)果血漿中藥物濃度: CBZ在1～17.0μg/ml，PT 在3～24.0μg/ml;各組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶值均在正常范圍，其它各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與正常兒童參考值P均大于0.05(表1);超聲波檢查，患兒肝臟形態(tài)大小正常，包膜完整，肝實(shí)質(zhì)回聲均勻，肝血管清晰可見(jiàn)，其內(nèi)未見(jiàn)異?；芈?患兒也未出現(xiàn)血液系統(tǒng)及消化系統(tǒng)不良反應(yīng)。

3　討論

3.1UPLC方法色譜條件參考抗癲癇藥物HPLC[2－5]的色譜條件，都不能得到滿意的UPLC色譜圖，減小流動(dòng)相的極性(減少甲醇比例)，二者分離度增加，但PT的色譜峰拖尾，在流動(dòng)相水中加入酸后，色譜峰有所改善，最終確定流動(dòng)相為甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55)。在本文中，UPLC色譜條件與文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC色譜條件不大一致可能的原因是二者C18色譜柱填料顆粒粒徑大小不同。

3.2單個(gè)樣本采集量因兒童采血較成人困難，最終確定單個(gè)樣本量(血漿)為200 μl，可以獲得理想色譜峰，且采血量易被家長(zhǎng)接受，可長(zhǎng)期配合醫(yī)生開(kāi)展治療藥物濃度監(jiān)測(cè)。

3.3癲癇藥物臨床應(yīng)用統(tǒng)計(jì)收集1667例癲癇患兒樣本中，只有150例服用CBZ(包括與丙戊酸聯(lián)合用藥31例)，PT為37例?？赡芘c下面因素有關(guān):①與治療藥物有效血藥度范圍寬窄和藥物副作用有關(guān)，如CBZ和PT比丙戊酸范圍要窄得多，故大部分醫(yī)生和家長(zhǎng)選擇丙戊酸，以便于更好控制患兒服藥劑量;②類似藥物心理效應(yīng)[6]，“家長(zhǎng)藥物心理效應(yīng)”影響癲癇患兒長(zhǎng)期用藥的種類，如在家長(zhǎng)配合醫(yī)生治療孩子癲癇疾病時(shí)，給孩子用藥易受到外界暗示(受到醫(yī)生、網(wǎng)絡(luò)、廣告和書(shū)籍等)，相對(duì)于CBZ和PT，家長(zhǎng)對(duì)丙戊酸治療癲癇更有藥物認(rèn)同感和更愿意選擇丙戊酸治療孩子疾病。

3.4實(shí)驗(yàn)室檢查和超聲檢查均未見(jiàn)報(bào)道不良反應(yīng)[2]，可能與樣本量小有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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收稿日期:( 2014.11.12)

基金項(xiàng)目:云南省高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)(計(jì)劃編號(hào): D－201254)。

【文章編號(hào)】1007－8517(2015)03－0025－03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號(hào)】R748