于金鵬,　伍國(guó)鋒,　王麗琨

?

慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元的模型建立

于金鵬,伍國(guó)鋒,王麗琨

目的建立一種簡(jiǎn)單易行的體外慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)方法。方法取懷孕的SD大鼠，分離體內(nèi)胎鼠的海馬后，經(jīng)Accutase消化后接種，采用無血清培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，選擇合適的時(shí)間將慢病毒加入神經(jīng)元內(nèi)，于不同的時(shí)間在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的顯影效果。結(jié)果慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元后，在第3天時(shí)觀察，細(xì)胞內(nèi)GFP在倒置熒光顯微鏡下顯影達(dá)到80%以上。結(jié)論此方法簡(jiǎn)單易行，慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的成功率高，為慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元后的后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

海馬；神經(jīng)元；慢病毒；轉(zhuǎn)染

海馬神經(jīng)元已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究，包括神經(jīng)元的發(fā)育分化、神經(jīng)元再生、神經(jīng)疾病的發(fā)生機(jī)制等方面。尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如AD、癲癇、腦血管疾病研究中更加突顯其作用的重要性，在疾病的發(fā)生機(jī)制中，為了研究相關(guān)基因?qū)Φ鞍椎恼{(diào)控作用，往往借助攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元后，進(jìn)行深入的研究。但是神經(jīng)元的培養(yǎng)對(duì)于實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高，同時(shí)，由于神經(jīng)元的生長(zhǎng)代謝緩慢，體外存活時(shí)間短，對(duì)外界的環(huán)境變化敏感，故慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元的難度增加。本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)單易行，慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的成功率高模型的實(shí)驗(yàn)方法，為慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元后的后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1慢病毒和主要試劑孕19 d的SPF級(jí)SD大鼠(E19)(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。Neurobasal?-A Medium (1X)、GlutaMAXTMSupplemen、B-27?Serum-Free Supplement (50X)、雙抗(青霉素/鏈霉素)、胎牛血清均購(gòu)自Gibco。DMEM/F12購(gòu)自Hyclone。多聚賴氨酸、Accutase酶購(gòu)自Sigma。Lentiviral vectors(上海吉?jiǎng)P基因)，Enhanced Infection Solution (上海吉?jiǎng)P基因)。

1.2海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)紫外燈照消毒超凈臺(tái)及操作間，并將手術(shù)器械高壓滅菌后備用。取出SD孕鼠，經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，解刨腹部，取出胎鼠，75%酒精清洗。用眼科剪刀斷其頭部剪開皮膚及顱骨，暴露雙側(cè)大腦半球，取出攜帶部分腦干的大腦組織，放入預(yù)冷的Hanks液培養(yǎng)皿中。用眼科無齒尖鑷小心分開皮質(zhì)，暴露并取出雙側(cè)海馬組織，盡量去除殘留的血管和腦膜，放入15 ml離心管中置于冰上。以上解剖應(yīng)在1 h內(nèi)完成。 用Hanks液清洗海馬組織，加入5倍于海馬組織體積的Accutase酶于37 ℃培養(yǎng)箱中消化10 min。當(dāng)海馬組織塊體積明顯減少時(shí)，終止液終止消化，加入種植液至3 ml。先用塑料巴斯德滴管吹打數(shù)次，至組織變小，再用火焰拋光的巴斯德滴管吹打3遍，用200目細(xì)胞篩過濾至另一個(gè)離心管內(nèi)，得到細(xì)胞原液。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×105/ml細(xì)胞密度接種于24孔板中，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后全量換液為飼養(yǎng)液培養(yǎng)，以后每周2～3次半量換液，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3海馬神經(jīng)元的鑒定一般在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7～14天時(shí)狀態(tài)最佳，因此本實(shí)驗(yàn)選擇在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天時(shí)進(jìn)行純度鑒定，采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (NSE)抗體免疫組化染色技術(shù)。免疫組化染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)及方法：以胞質(zhì)或突起染成棕黃色為陽(yáng)性神經(jīng)元。在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)其陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，重復(fù)5次，取其均值作為陽(yáng)性神經(jīng)元的百分率。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元按照上海吉?jiǎng)P公司的慢病毒手冊(cè)，按照不同的感染復(fù)數(shù)(MOI),分別在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天、第7天時(shí)，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，24 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h后在通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)，并用MTB2011 Configuration 2.2.0.6分析病毒轉(zhuǎn)染效率。MOI分別選取5、10、15、20。

2　結(jié)　果

2.1神經(jīng)元純度的測(cè)定用 NSE對(duì)海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定， 所得陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的純度為(86.32±1.48)%。

2.2慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)間及轉(zhuǎn)染效率的鑒定在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天、第7天時(shí)，分別進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，并設(shè)計(jì)不同的MOI，72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP細(xì)胞內(nèi)顯影效果，觀察海馬神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天，及MOI=10時(shí)，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最佳狀態(tài)，可到達(dá)80%以上，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

3　討　論

3.1原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)一直以來神經(jīng)元在原代培養(yǎng)中都是棘手的問題，選擇胎鼠作為取材，提取細(xì)胞的活性好，易于后續(xù)的慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元。筆者總結(jié)了如下經(jīng)驗(yàn):(1)實(shí)驗(yàn)從取材到接種完畢的時(shí)間一定控制在2 h內(nèi)完成;(2)在海馬神經(jīng)元貼壁4 h后，立即進(jìn)行全量無血清培養(yǎng)基換液，不僅盡早清除雜質(zhì)，也降低神經(jīng)元的分化[1～3];(3)在消化海馬組織時(shí)，鑒于胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的毒性大，且消化時(shí)間和濃度不宜控制，故采用Accutase酶;(4)在抑制膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖方面，用無血清培養(yǎng)，添加了B27補(bǔ)充劑，促進(jìn)神經(jīng)元的成長(zhǎng)，抑制了膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。此實(shí)驗(yàn)方法可獲得高純度、高活力的海馬神經(jīng)元，操作簡(jiǎn)單，無需特殊設(shè)備。

3.2慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生機(jī)制研究中，往往借助于慢病毒攜帶目的基因來研究靶點(diǎn)蛋白的調(diào)控變化，但是多數(shù)考慮慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的效率低，采用細(xì)胞系代替，但本文提供慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元的方法，也是簡(jiǎn)單易行，轉(zhuǎn)染效率高，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)如下：(1)選擇胎鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染；(2)轉(zhuǎn)染時(shí)間的選擇，在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天時(shí)為適宜;(3)轉(zhuǎn)染時(shí)，不宜加轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，由于轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑對(duì)神經(jīng)元有毒性，不僅會(huì)引起細(xì)胞死亡，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變異。同時(shí)，采用Enhanced Infection Solution 作為緩沖稀釋病毒液，進(jìn)行無血清培養(yǎng)，雙抗對(duì)于慢病毒的轉(zhuǎn)染效率無關(guān)；轉(zhuǎn)染24 h后換液，更換為無病毒的維持培養(yǎng)基飼養(yǎng)[4～8]。4 h、72 h后，在熒光顯微下觀察神經(jīng)元內(nèi)的GFP顯影效率，在MOI=10時(shí)，可達(dá)到80%以上，通常熒光會(huì)持續(xù)2～3 d，在第6天時(shí)，GFP熒光開始消失。

本文的慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元的方法簡(jiǎn)單，且效率高，為后續(xù)借助其研究海馬神經(jīng)元相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，提供很好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑫r(shí)也為進(jìn)一步研究海馬神經(jīng)元的相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]Yi-Shuian Huang,Joel D.Richter.Analysis of mRNA translation in cultured hippocampal neurons[J].Methods in Enzymology，2007，431：143-162.

[2]Alessandra L,Scotti M,Gudrun Herrmann.Reelin immunoreactivity in dissociated cultures of the postnatal hippocampus[J].Brain Research,2002,924:209-218.

[3]Andreas Grabrucker，Bianca Vaida，Jargen Bockmann，et al．Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture[J].Cell Tissue Res，2009，338:333-341.

[4]Naseer Ml,Lee HY,Ullah N,et al.siRNA-mediated GABA(B) receptor at early fetal rat brain upon acute and chronic ethanol exposure:down regulation of PKA and p-CREB expression Synapse[J].Neuroscience Synapse,2011,65(2):109-118.

[5]Fang M,Feng C,Zhao YX,et al．Camk2b protects neurons from homocysteine-induced apoptosis with the involvement of HIF-1αsignal pathway[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(7):1659-1668.

[6]Scott B,Sun CL,Mao X,et al.Role of Oxygen consumption in hypoxiaprotection by translation factor depletion[J].J Exp Biol,2013，216(12):2283-2292.

[7]Chen X,Nelson CD,Li X,et al.PSD 95 is required to sustain the molecular organization of the postsynaptic density[J].J Neurosci,2011,31(17)：6329-6338.

[8]Edelman DB,Owens GC,Chen S.Neuromodulation and mitochondrial transport:live imaging in hippocampal neurons over long durations[J].J Vis Exp,2011,17(52):2599.

Establishing model of lentivirus transfection of hippo-campal neurons

YUJinpeng,WUGuofeng,WANGLikun.

(EmergencyDepartmentofNeurology,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

ObjectiveTo establish a simple and practical method of slow virus in vitro transfection method of hippocampal neurons.MethodsThe hippocampus were isolated from neonatal rat(1 d),and digested with accutase.Hippocampal neurons were planted and cultuted with serum-free neurobassal.The Lentivirus were added into the neurons at the appropriate time,then observe the enhancement effect of GFP in the cell at different timesIn the inverted fluorescence microscope.ResultsHippocampal neuron cultures are infected after 3 days in vitro by simply adding the amount of virus,and estimated to infect up to 80% of all neurons based on checking for fluorescent protein expression In the inverted fluorescence microscope.ConclusionsThe persent protocol is a simple and efficient method for lentiviral transfection of hippocampal neurons.

Hippocampus;Neurons;Lentiviral vectors;Transfection

1003-2754(2016)02-0161-02

2015-10-09；

2015-11-30

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診神經(jīng)內(nèi)科,貴州 貴陽(yáng) 550004)

伍國(guó)鋒，E-mail:wuguofeng3013@sina.com

R741

A