劉書中,李子全,李政垚,王以朋

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 骨科,北京市100730)

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外周血miRNAs檢測在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的意義研究進展

劉書中,李子全,李政垚,王以朋*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 骨科,北京市100730)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎、進行性骨質(zhì)破壞和關(guān)節(jié)功能喪失為特征的自身免疫性疾病，發(fā)病率約為1%，好發(fā)年齡為35-50歲，女性多于男性[1]。RA的主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜增厚、大量炎癥細(xì)胞浸潤、血管翳形成以及軟骨的侵蝕與破壞，致殘率高，多數(shù)患者確診時全身多個關(guān)節(jié)已出現(xiàn)進行性破壞，預(yù)后較差。研究表明RA的發(fā)生與基因變異、致病性內(nèi)外抗原、免疫細(xì)胞異常激活及miRNA的異常調(diào)節(jié)等多種因素有關(guān)[2]。目前RA的發(fā)病機制尚不明確，深入研究RA分子生物學(xué)特征對于RA的診斷和治療具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在真核生物中發(fā)現(xiàn)的長18-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA。研究表明miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生、分級分期、耐藥性、預(yù)后等密切相關(guān)，參與了細(xì)胞重要生物學(xué)行為的調(diào)控,間接地發(fā)揮“促癌和抑癌”等功能，miRNAs的深入研究為多種疾病的診斷和治療提供了新思路。影響RA疾病預(yù)后的關(guān)鍵在于能否早期診斷、自身免疫反應(yīng)程度和病變累及范圍，研究顯示外周血miRNAs水平與RA的病情進展密切相關(guān)，有望成為RA診斷及預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)記物及治療靶標(biāo)[3]。鑒于外周血miRNA水平與RA的相關(guān)性逐漸被發(fā)現(xiàn)并證實，本文就近年外周血miRNA水平在RA診療及預(yù)后評估領(lǐng)域的研究進展做一綜述。

1miRNA的分子生物學(xué)特征

miRNA生成過程中,編碼miRNA的基因首先在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄,在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄為幾百至幾千堿基的初級產(chǎn)物(pri-miRNA),pri-miRNA在核內(nèi)核酸內(nèi)切酶Drosha酶作用下切割成只含60-70堿基的具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾樣前體(pre-miRNA),pre-miRNA被RNAGTP2依賴的轉(zhuǎn)運體exportins5轉(zhuǎn)運至胞漿,在IIIDicer酶(雙鏈RNA專一性內(nèi)切酶)作用下形成具有雙鏈結(jié)構(gòu)的miRNA,在酶的作用下裂解成22個核苷酸的成熟miRNA與互補鏈miRNA*。而miRNA*立即被降解。

miRNA的主要分子生物學(xué)特征包括:(1)通常長度為18-25nt,3’端可以有2-3個nt的變化,長度不定。(2)廣泛存在于真核生物中,不具有開放閱讀框架(ORF,open read frame),不編碼蛋白質(zhì)。(3)成熟后的miRNA5’端為磷酸基團,3’端是羥基基團,這一特點可以使miRNA與功能性RNA降解生成片段相區(qū)分，miRNA通過與靶基因mRNA3’-UTR完全或不完全的互補配對結(jié)合,致使靶mRNA降解或翻譯抑制進而調(diào)控靶基因的表達(dá),從而影響細(xì)胞增殖、侵襲、分化和凋亡等多種生物學(xué)行為。(4)miRNA在多種種屬中的表達(dá)具有保守性。(5)miRNA的表達(dá)具有時序性和組織特異性。miRNA的保守性、時序表達(dá)特異性和組織表達(dá)特異性提示其在生命活動的微觀層面發(fā)揮重要作用[4]。

miRNA的功能由RNA所介導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)介導(dǎo),最終引起蛋白質(zhì)翻譯受抑或者同源mRNA降解等生物過程[5]。大量研究顯示miRNA可調(diào)節(jié)人類近60%的蛋白編碼基因,miRNA與靶mRNA并非完全互補配對,平均每個miRNA可以直接調(diào)節(jié)人類200種不同的mRNA,多個miRNA可以協(xié)同調(diào)節(jié)某些特殊靶基因,多個miRNAs也可能共同調(diào)節(jié)同一基因靶點,這種協(xié)同調(diào)節(jié)模式形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此每一個miRNA的異常表達(dá)都有可能導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)的表達(dá)異常[6,7]。

2外周血miRNA檢測在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷、治療及預(yù)后評估中的意義

2.1miRNA在外周血中的表達(dá)及檢測方法

外周血miRNA可能來源于凋亡壞死腫瘤細(xì)胞、血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的裂解等。最新研究顯示外周血miRNA可能來自組織細(xì)胞的主動分泌過程，成熟的miRNA在細(xì)胞內(nèi)被脂蛋白包被成外切酶體分泌至細(xì)胞外，最終到達(dá)血液。由于大多數(shù)miRNA是由細(xì)胞分泌的，組織細(xì)胞中miRNA與循環(huán)miRNA必然有一定的聯(lián)系。研究結(jié)果表明miRNA在組織和體液中具有相同的改變趨勢[8]。實驗表明外周血中RNA在室溫下過夜、反復(fù)凍存、解凍、煮沸、過酸或過堿等惡劣情況下可以維持穩(wěn)定，進一步證實了循環(huán)miRNA替代組織活檢而成為新型生化指標(biāo)的可能。

目前檢測miRNA的方法有克隆測序、Northern印記雜交、原位雜交、基因芯片、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)等[9]。其中應(yīng)用最廣泛的是qRT-PCR技術(shù)，能區(qū)分miRNA前體和成熟體，只定量具有生物活性的成熟miRNA，可精確區(qū)分同一家族中序列高度同源的miRNA，能檢測只有一個堿基差別的不同miRNAs表達(dá)水平，靈敏度和特異度高，樣品消耗量少，只需要l-l0ngRNA即能檢測出低豐度靶miRNA，定量線性范圍寬，有著在臨床檢測領(lǐng)域大規(guī)模推廣的潛力。

2.2外周血miRNAs檢測在RA中的意義

2.2.1外周血miR-16檢測在RA中的意義Murata等[10]采用qRT-PCR技術(shù)檢測RA患者、骨關(guān)節(jié)炎患者及健康對照者血漿及關(guān)節(jié)滑液中miR-16，miR-132，miR-146a，miR-155及miR-223表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)健康對照組血漿miR-132水平較RA組和OA組顯著升高，其具有診斷意義。RA組關(guān)節(jié)滑液中miR-16、miR-146a、miR-155、miR-223濃度較OA組顯著升高，可能與局部炎癥刺激有關(guān)，并且血漿miR-16與miR-146a水平與疼痛關(guān)節(jié)數(shù)(tender joint count，TJC)和DAS28(28-joint Disease Activity Score)呈顯著負(fù)相關(guān)，結(jié)果提示血漿miR-16表達(dá)水平可以作為RA活動的分子標(biāo)志，血漿miRNAs表達(dá)水平對RA發(fā)病機制闡明及診療具有重要價值。此外，有研究表明血漿miRNA數(shù)量或miRNA在滑膜液和血漿中的比例與關(guān)節(jié)損傷程度密切相關(guān)。Wang等[11]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血miR-16、miR-21、miR-451、miR-223表達(dá)水平顯著升高。孫寅等[12]研究表明miR-16 在血漿中的表達(dá)水平顯著高于關(guān)節(jié)滑液以及外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(P<0.01)，上調(diào)變化倍數(shù)分別為8.7倍和9.6倍，miR-16在關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)水平高于PBMC，上調(diào)變化倍數(shù)為1.5倍，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，miR-16在RA患者血漿中的表達(dá)水平低于正常健康人，下調(diào)變化倍數(shù)為0.65倍，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，miR-16在RA患者PBMC中的表達(dá)水平顯著高于正常健康人(P<0.01)，上調(diào)變化倍數(shù)為1.9倍。研究還證實血漿miR-16的表達(dá)與DAS28評分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、病程、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation tate，ESR)及C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)均無關(guān)(P>0.05)，PBMC中miR-16的表達(dá)與DAS28評分、ESR 及CRP呈正相關(guān)(P < 0.05)，與年齡、性別及病程無關(guān)(P> 0.05)。研究證實檢測miR-16在外周血中的表達(dá)可為臨床對RA與OA進行鑒別診斷以及深入探索RA的發(fā)病機制提供新的思路，血漿miR-16的表達(dá)水平有望成為評價RA 病情活動度的有效指標(biāo)。鄭錫銘等[13]檢測80例RA患者、32例骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者及32例健康對照者血漿、PBMC及關(guān)節(jié)液miR-16的表達(dá)量，并與RA活動性監(jiān)測指標(biāo)類風(fēng)濕因子(RF)、ESR、CRP進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示RA組血漿、PBMC和關(guān)節(jié)液中miR-16相對于OA組、健康對照組表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，血漿miR-16水平與一個或多個RA活動性監(jiān)測指標(biāo)呈正相關(guān)(P<0.05)。此外，Hanson等[14]首次指出miRNA 圖譜可作為法醫(yī)體液鑒定的方法，并發(fā)現(xiàn)在死亡機體的外周血及其它體液中幾乎都能檢測到452種miRNA，但這452種miRNA在不同體液中的表達(dá)量不同。其中外周血miR- 16能在含量僅為50pg的條件下被檢測鑒別出來。

2.2.2外周血miR-146a檢測在RA中的意義研究表明miR-146a功能缺陷是導(dǎo)致TNF-α在RA患者體內(nèi)持續(xù)表達(dá)的重要原因，miR-146a可通過下調(diào)IRAK1的表達(dá)抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖及IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮抑制RA滑膜炎癥的作用。馮知濤等[15]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測RA患者活動組24例、緩解組16例及健康對照16例PBMCs中miR-146a、miR-16表達(dá)水平，并與RA患者臨床指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示RA組miR-146a、miR-16的表達(dá)高于健康對照組(P<0.05)，在RA活動組與緩解組的比較中發(fā)現(xiàn)活動組miR-146a、miR-16表達(dá)水平高于緩解組(P<0.05)。RA組miR-146a、miR-16的表達(dá)與ESR、CRP及DAS28評分之間呈正相關(guān)(P<0.01)，與RF無相關(guān)性(P>0.05)。研究證實RA患者外周血miR-146a和miR-16表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與RA病情活動相關(guān)，提示miR-146a和miR-16的檢測可作為RA病情活動的判斷指標(biāo)。高登文等[16]也通過研究證實RA 患者PBMC中miR-146a表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與RA病情活動程度有關(guān)。劉琴等[17]用SYBR Green I qRT-PCR檢測RA患者48例(活動期30例，緩解期18例)、骨性關(guān)節(jié)炎患者22例和體檢健康者25例血清miR-146a的表達(dá)水平，并進行ROC曲線分析，對各組進行ESR檢測，結(jié)果表明活動期RA患者血清miR-146a相對表達(dá)水平為(2.42 ±0.75)，顯著高于緩解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和體檢健康者(1.01±0.34 )，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-146a診斷活動期RA的ROC曲線下面積為0.914 (95%CI：0.872-0.926)，以1.96為臨界值，敏感性為95.0%，特異性為87.5%，準(zhǔn)確性為91.9%，研究結(jié)果表明血清miR-146a水平可用于診斷活動期RA。

2.2.3外周血miR-155檢測在RA中的意義Ormseth等[18]采用qRT-PCR技術(shù)分析RA患者血漿中7種miRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者血漿中miR-155-5p、miR-15a-5p、miR-24-3p、miR-26a-5p、miR-125a-5p、miR-146a-5p及miR-223-3p表達(dá)水平均顯著升高，其中miR-24-3p診斷RA準(zhǔn)確率最高(AUROC=0.725)，研究還證實聯(lián)合檢測血漿miR-24-3p、miR-26a-5p和miR-125a-5p水平診斷RA準(zhǔn)確率最高 (AUROC=0.747)，血漿miR-155-5p水平與關(guān)節(jié)腫脹評分相關(guān)(P=0.024)，血漿中7種miRNA表達(dá)水平與疾病活動度及心血管風(fēng)險無顯著相關(guān)性。Kaleb等[19]的實驗顯示在PBMC中RA患者miR-146a、miR-155、miR-132、miR-16的含量分別是健康對照組的2.6、1.8、2.0、1.9 倍，但miR-let-7a的表達(dá)在RA與健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。荀春華等[20]采用qRT-PCR檢測隨機選取的43例RA患者和30例健康體檢者血漿和PBMC中四種miRNAs(miR-146a、miR-223、miR-16和miR-155)的表達(dá)，結(jié)果表明與對照組相比，RA組患者血漿中miR-146a和miR-155表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，PBMC中四種miRNAs表達(dá)均上調(diào)(P < 0.05)，相關(guān)性分析顯示四種miRNAs在血漿和PBMC中的表達(dá)沒有明顯相關(guān)性。

2.2.4外周血miR-223檢測在RA中的意義Carmen等[21]選取95例RA患者，分析納入對象經(jīng)抗TNF-α/改良抗風(fēng)濕藥物(抗TNF-α/DMARDs)聯(lián)合治療后血清miRNA水平變化，研究表明經(jīng)抗TNF-α/DMARDs聯(lián)合治療后血清miR-16-5p，miR-23-3p，miR-125b-5p，miR-126-3p，miR-146a-5p，miR-223-3p水平顯著升高，此外研究還證實血漿miR-23與miR-223水平也可作為判斷抗TNF-α/DMARDs聯(lián)合治療效果的新型生化指標(biāo)。Mária等[22]檢測RA早期(ERA)患者、RA確診患者及健康對照者血清miR-146a、miR-155、miR-223、miR-16等表達(dá)水平，結(jié)果表明RA早期患者miR-146a、miR-155和miR-16水平較RA確診患者顯著升高，治療3個月期間循環(huán)miR-16水平變化與RA早期患者DAS28評分改變密切相關(guān)(P=0.002)，治療期間循環(huán)miR-223水平與C反應(yīng)蛋白(P=0.008)、DAS28評分(P=0.031)、治療3月后DAS28評分(P=0.003)及治療12月后DAS28評分(P=0.011)密切相關(guān)，但在本研究中血清miR-16與miR-223水平不能區(qū)分ERA患者與健康對照者。該研究證實miR-16與miR-223可反映ERA疾病活性并預(yù)測疾病進展。

2.2.5其他外周血miRNAs檢測在RA中的意義Geoffrey等[23]采用基因芯片及qRT-PCR技術(shù)證實miR-595和miR-1246在RA患者血清中表達(dá)水平顯著升高(P=0.024，P=0.036)，并可作為RA疾病診療的新型生化指標(biāo)。Isabelle等[24]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測48例RA患者、7例骨關(guān)節(jié)炎患者及13例健康對照者全血和血清中miR-125b表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)在RA疾病發(fā)作期血清miR-125b水平與3月后利妥昔單抗臨床治療RA的效果呈正相關(guān)(P=0.002)，其血清表達(dá)水平可作為判斷利妥昔單抗治療效果較好的預(yù)測指標(biāo)。Murata等[25]檢測并驗證了113例RA患者及115例健康對照者血漿miRNAs水平，結(jié)果顯示miR-125a-5p、miR-24、miR-26a對RA疾病診斷具有重要價值(AUC=0.83、0.80、0.80)，并且在抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)陽性及陰性患者中表達(dá)水平無顯著差異。Krintel等[26]選取89例阿達(dá)木單抗40 mg治療患者與91例安慰組對照患者并檢測377種外周血miRNA表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)外周血miR-22低表達(dá)與miR-886.3p高表達(dá)提示RA患者應(yīng)用阿達(dá)木單抗治療效果較為理想，聯(lián)合二者預(yù)測RA患者阿達(dá)木單抗治療效果尚需進一步研究。Yang等[27]采用qRT-PCR技術(shù)分析RA患者血清及滑液中miR-221表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示RA患者血清及滑液中miR-221表達(dá)水平顯著高于健康對照組，miR-221表達(dá)下調(diào)可顯著抑制促炎細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)。

3結(jié)語及展望

外周血中多種miRNAs在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中均有異常表達(dá)，并且其水平隨著RA病情進展而相應(yīng)改變。多項研究表明外周血miRNA水平可作為RA診斷、病情進展及預(yù)后評估的新型生化指標(biāo)，并有望為RA的治療提供新的靶點。

近年來，針對miRNA的研究已成為國際上熱點研究內(nèi)容之一，對外周血中miRNA的研究也逐漸開展，但目前miRNA的臨床相關(guān)研究還缺乏大樣本、多中心的數(shù)據(jù)論證。由于miRNA作用的多重性，使有關(guān)外周血miRNA的研究方向得以不斷擴展。但其特異性作用機制等尚需進一步探討，以期早日應(yīng)用于臨床。隨著研究內(nèi)容不斷深入，外周血miRNAs檢測將在RA的早期診斷、鑒別診斷、治療及預(yù)后判斷等諸多方面展現(xiàn)出更為廣泛的應(yīng)用前景，并且為RA的診斷、治療及預(yù)后評估起到推動作用。

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*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1212-04

(收稿日期：2015-08-12)