李佳婕 劉海嬌 劉文濤 張廣欽

L-型半胱氨酸通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9和-2活性緩解神經(jīng)病理性疼痛

李佳婕 劉海嬌 劉文濤 張廣欽

目的本研究擬評估L-半胱氨酸通過抑制脊髓水平基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9和MMP-2活性,從而緩解神經(jīng)病理性疼痛的可能性。方法通過測定動物機(jī)械學(xué)痛閾考察L-半胱氨酸對神經(jīng)病理性疼痛的作用,同時用明膠酶譜法檢測L-半胱氨酸對脊髓MMP-9和-2活力的抑制。結(jié)果L-半胱氨酸可以劑量依賴性地緩解大鼠慢性神經(jīng)損傷模型誘導(dǎo)的機(jī)械學(xué)痛覺異常,并且在體外和體內(nèi)均能顯著抑制模型大鼠脊髓中MMP-9/2的活力。結(jié)論L-半胱氨酸可能通過抑制MMP-9和-2的活力來緩解神經(jīng)病理性疼痛。

神經(jīng)病理性疼痛； 基質(zhì)金屬蛋白酶 ；半胱氨酸

神經(jīng)病理性疼痛被定義為軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷所導(dǎo)致的疼痛［1］,它在臨床上發(fā)病十分廣泛,許多疾病都會導(dǎo)致神經(jīng)損傷進(jìn)而引發(fā)疼痛。現(xiàn)有治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物針對靶點(diǎn)多為神經(jīng)元離子通道或神經(jīng)遞質(zhì),雖然有一定的鎮(zhèn)痛療效,但常會引起較嚴(yán)重的不良反應(yīng),極大的限制了其長期應(yīng)用。

近年來,人們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化引起的神經(jīng)炎癥在疼痛中起著極其重要的作用。MMP-9和-2屬于明膠酶,有研究發(fā)現(xiàn)它們能夠由膠質(zhì)細(xì)胞合成并釋放到胞外,通過促進(jìn)炎癥因子pro-IL-1β向成熟體IL-1β轉(zhuǎn)化［2］誘導(dǎo)IL-1β的激活,并作用于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上的相應(yīng)受體激活下游信號通路,引起疼痛；MMP-9/2也能通過剪切細(xì)胞表面相關(guān)蛋白,促進(jìn)神經(jīng)元上N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)、α氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑酸受體 (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor,AMPAR)等谷氨酸受體向膜上轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而增加神經(jīng)元興奮性［3］,導(dǎo)致疼痛。因此MMP-9/2已成為近來發(fā)現(xiàn)的治療神經(jīng)病理性疼痛的新靶點(diǎn)。然而至今還沒有一個安全有效的MMP-9/2抑制劑能夠應(yīng)用于臨床。因此,迫切需要尋找一種已經(jīng)應(yīng)用于臨床,同時能有效的抑制MMP-9/2活性的藥物,來治療神經(jīng)病理性疼痛。

MMP-9/2中有一個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)——半胱氨酸開關(guān),半胱氨酸殘基的氧化是MMP激活的關(guān)鍵［4］。L-半胱氨酸為生物體內(nèi)合成的含硫非必需氨基酸,在臨床上作為重金屬中毒的解毒劑,并用于治療由于使用抗癌藥物和放射性藥物所引起的白血球減少癥。本研究擬驗(yàn)證能否使用外源性L-半胱氨酸,作為一個半胱氨酸開關(guān)的類似物,保護(hù)MMP-9和MMP-2中半胱氨酸殘基,抑制MMP-9/2的激活,從而緩解神經(jīng)病理性疼痛?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 L-半胱氨酸(生興生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動物 健康成年雄性SD大鼠,體重為180～220 g,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SCXK(蘇)2014-0001。

1.3 儀器 足底測試儀(意大利UGO BASILE 公司)；電泳儀(美國Bio-Rad 公司)；化學(xué)發(fā)光儀(ChemiDoc XRS+,美國Bio-Rad 公司)。

1.4 方法

1.4.1 建立CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型 大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷模型(chronic constriction injury,CCI):大鼠經(jīng)水合氯醛(300mg/kg,腹腔注射)麻醉后,分離坐骨神經(jīng)并寬松結(jié)扎,縫合肌肉層和表皮層。使用足底測試儀檢測大鼠機(jī)械痛閾,以術(shù)后14 d大鼠機(jī)械痛閾下降＞40%為造模成功。假手術(shù)組以水合氯醛麻醉手術(shù)但不結(jié)扎神經(jīng)。

1.4.2 觀測CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠機(jī)械學(xué)痛閾 采用足底測試儀觀測大鼠的機(jī)械痛閾,具體方法如下：在安靜、溫度20～25 ℃的環(huán)境中,將大鼠置于透明的金屬網(wǎng)格籠中,測定前使之適應(yīng)20min,探覓行為停止后開始測量。以足底測試儀的平鈍針尖刺激大鼠足底,由無壓力逐漸緩慢加壓至動物縮足,每次測量間隔3min,引起大鼠足爪抬起的最小壓力為其機(jī)械性刺激縮足反射閾值。每只大鼠至少平行測量4次取平均閾值,并計算SEM值。

1.4.3 L-半胱氨酸對CCI 激活的MMP-9 和MMP-2的影響采用明膠酶譜法檢測MMP-9/2的活力,具體操作如下：大鼠使用水合氯醛麻醉處死后取脊髓(L1～6),在1% NP40 裂解液中剪碎勻漿,提取上清,經(jīng)過明膠瓊脂糖凝膠4B提純,加入上樣緩沖液,渦旋混勻,在分離膠中加入1%的明膠,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,并對分離膠進(jìn)行洗脫、孵育,用1%考馬斯亮藍(lán)染色,經(jīng)脫色后,使用化學(xué)發(fā)光儀采集圖像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L-半胱氨酸對CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠機(jī)械學(xué)痛閾的影響 實(shí)驗(yàn)動物分為五組,CCI模型組、CCI模型加半胱氨酸給藥組(50、100、200mg/kg,灌胃給藥)以及對照組(給予等體積生理鹽水)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在大鼠CCI 造模后第14天,與基礎(chǔ)值相比,大鼠的機(jī)械痛閾由(13.54±0.40)g降至(5.13±1.30)g,表示模型成功建立。L-半胱氨酸能劑量依賴性的緩解CCI引起的痛覺異常,50、100、200mg/kg給藥組灌胃給藥2 h后CCI引起的神經(jīng)痛模型大鼠的機(jī)械閾值與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),分別使CCI引起的神經(jīng)痛模型大鼠的機(jī)械閾值上升到對照組的30.9%,44.7%和68.8%。見圖1。

2.2 L-半胱氨酸對CCI 激活的MMP-9 和MMP-2的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示L-半胱氨酸能在體內(nèi)顯著抑制CCI誘導(dǎo)的MMP-9/2的激活,50mg/kg的劑量抑制MMP-9和MMP-2的效率分別達(dá)到44.3%和25.5%。見圖2A-2B。同時,L-半胱氨酸在體外也能夠顯著地直接抑制MMP-9/2的活力,10-5mol/L的L-半胱氨酸對MMP-9的抑制效率達(dá)到79.7%,對MMP-2的抑制效率達(dá)到75.6%。見圖2C-2D。

3 討論

明膠酶MMP-9和MMP-2,在神經(jīng)病理性疼痛中有著至關(guān)重要的作用。MMP-9/2一方面能夠通過促進(jìn)pro-IL-1β向成熟體IL-1β轉(zhuǎn)化［2］,活化的IL-1β通過作用于神經(jīng)元上的IL-1受體激活下游信號通路,使神經(jīng)元上N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)的激活,使鈣離子內(nèi)流增加,增強(qiáng)突觸信號傳導(dǎo),進(jìn)而引發(fā)疼痛［5］。另一方面,MMP-9/2還能夠直接通過對NMDA受體功能性亞基NR-1以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族蛋白細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal- regulated kinases,ERK)的磷酸化直接增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性,從而引起中樞敏化維持疼痛［6］。

半胱氨酸開關(guān)是MMP-9/2激活過程中一個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu),它由MMP-9/2肽鏈中的半胱氨酸殘基,與鋅離子活性位點(diǎn)組成。一般情況下,兩者結(jié)合,覆蓋活性位點(diǎn),MMP-9/2不能發(fā)揮酶活性。當(dāng)半胱氨酸殘基被氧化,與酶活性位點(diǎn)分離,MMP-9/2則被激活,發(fā)揮酶活性［7］。而L-半胱氨酸,作為體內(nèi)一種還原性氨基酸,又是MMP-9/2中半胱氨酸殘基的類似物,應(yīng)當(dāng)能夠保護(hù)其半胱氨酸殘基不被氧化,從而抑制它的激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證明,L-半胱氨酸能夠在體外直接抑制CCI 誘導(dǎo)的MMP-9/2激活。

本研究還發(fā)現(xiàn),L-半胱氨酸對于CCI 誘導(dǎo)的機(jī)械學(xué)痛覺異常有顯著的緩解作用,同時L-半胱氨酸體內(nèi)給藥也能夠顯著抑制CCI造模所引起的MMP-9/2的激活,因此提示L-半胱氨酸可能通過抑制MMP-9/2活力來緩解疼痛。

已有報道發(fā)現(xiàn),在阿爾茲海默癥模型中,腦中MMP-9/2的表達(dá)增加,促進(jìn)淀粉樣-β肽降解,從而加速阿爾茲海默癥的進(jìn)展［8］,外源性給予L-半胱氨酸的衍生物對阿爾茲海默癥也有一定緩解作用［9］。同樣,鎘中毒也能誘導(dǎo)MMP-9/2的高表達(dá)［10］,給予L-半胱氨酸可以有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞［11］。而有研究表明神經(jīng)病理性疼痛時脊髓和DRG中MMP-9/2表達(dá)和活力均顯著上調(diào)［2］,此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明L-半胱氨酸可以抑制MMP-9/2活力,且能夠有效的緩解疼痛癥狀,與上述研究相符合。

綜上所述,L-半胱氨酸能夠有效緩解神經(jīng)病理性疼痛,并對其可能的機(jī)制,即抑制MMP-9和-2的活力,在體內(nèi)和體外進(jìn)行了考察。作者的研究為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供了一種新的安全有效的藥物,并為以半胱氨酸開關(guān)為靶點(diǎn),調(diào)節(jié)MMP-9/2活力來開發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供了新的思路。

［1］Watson JC,Sandroni P.Central neuropathic pain syndromes.Mayo Clin Proc,2016,91(3):372-385.

［2］Kawasaki Y,Xu ZZ,Wang X,et al.Distinct roles of matrix metalloproteases in the early- and late-phase development of neuropathic pain.Nature Medicine,2008,14(3):331-336.

［3］Huntley GW.Synaptic circuit remodelling by matrix metalloproteinases in health and disease.Nature Reviews Neuroscience,2012,13(11): 743-757.

［4］Atreya S.Pregabalin in chemotherapy induced neuropathic pain.Indian J Palliat Care,2016,22(1):101-103.

［5］Grace PM,Hutchinson MR,Maier SF,et al.Pathological pain and the neuroimmune interface.Nature Reviews Immunology,2014,14(4):217-231.

［6］Liu YC,Berta T,Liu T,et al.Acute morphine induces matrix metalloproteinase-9 up-regulation in primary sensory neurons to mask opioid-induced analgesia in mice.Molecular Pain,2012,8(19):1512.

［7］Van Wart HE,Birkedal-Hansen H.The cysteine switch: A principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1990,87(14):5578-5582.

［8］Backstrom JR,Lim GP,Cullen MJ,et al.Matrix metalloproteinase-9 (mmp-9) is synthesized in neurons of the human hippocampus and is capable of degrading the amyloid-beta peptide (1-40).J Neurosci,1996,16(24):7910-7919.

［9］Adair JC,Knoefel JE,Morgan N.Controlled trial of n-acetylcysteine for patients with probable alzheimer's disease.Neurology,2001,57(8):1515-1517.

［10］Kirschvink N,Vincke G,Fievez L,et al.Repeated cadmium nebulizations induce pulmonarymmp-2 andmmp-9 production and emphysema in rats.Toxicology,2005,211(1-2):36-48.

［11］Carageorgiou H,Tzotzes V,Pantos C,et al.In vivo and in vitro effects of cadmium on adult rat brain total antioxidant status,acetylcholinesterase,(Na+,K+)-ATPase and Mg2+-ATPase activities: Protection by l-cysteine.Basic Clin Pharmacol Toxicol,2004,94(3):112-118.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.07.212

2015-12-07］

210009 中國藥科大學(xué)/臨床藥學(xué)教研室(李佳婕劉海嬌 張廣欽)；南京醫(yī)科大學(xué)/江蘇省神經(jīng)退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(劉文濤)

張廣欽