李建秋，李 立，閆鴻斌，婁忠子，賈萬忠

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046)

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石渠棘球絳蟲Es95基因克隆及序列分析

李建秋，李 立，閆鴻斌，婁忠子，賈萬忠*

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046)

包蟲病(Echinococcosis)，又稱棘球蚴病，是由棘球?qū)俳{蟲的幼蟲寄生于中間宿主體內(nèi)引起的一種重要的人獸共患寄生蟲病。該病呈世界性分布，給全球造成了嚴重的經(jīng)濟問題和公共衛(wèi)生問題。棘球絳蟲的成蟲主要寄生于犬科動物(家犬、藪狗、狼、狐、豺狼、北貉及土狼)、貓科動物(獅、美洲獅、美洲虎及美洲山貓)和鬣狗科動物的小腸內(nèi)，卵通過糞便排出體外，并污染周圍環(huán)境。易感的中間宿主通過偶然食入蟲卵而受到感染。人是棘球蚴非適宜性宿主，除特殊情況外在寄生蟲生活史中不產(chǎn)生任何作用。然而，它們嚴重的發(fā)病率和致死率可引起重大的社會和經(jīng)濟問題。根據(jù)最新的分子及系統(tǒng)進化分析，棘球絳蟲主要包括9個成員，即廣義上的細粒棘球絳蟲(E.granulosus)(包括E.granulosus的3個基因型G1～G3)，馬棘球絳蟲(E.equinus)(G4)，奧氏棘球絳蟲(E.ortleppi)(G5)，加拿大棘球絳蟲(E.canadensis)(G6～G10)，獅棘球絳蟲(E.felidis)，多房棘球絳蟲(E.multilocularis)，少節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthrus)，石渠棘球絳蟲(E.shiquicus)及福氏棘球絳蟲(E.vogeli)[1]。

1993年，第16屆國際包蟲病大會(北京)上，我國學者報道了在高原鼠兔肺臟上發(fā)現(xiàn)了細粒棘球絳蟲包囊，高原鼠兔作為青藏高原上一種常見的嚙齒類動物，且是多房棘球絳蟲的中間宿主[2]。1995年，QIU等[3]在藏狐體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了石渠棘球絳蟲的成蟲，但當時認為是多房棘球絳蟲的變異體。2005年，Xiao等[4]在四川省甘孜州石渠縣從高原鼠兔肝臟分離出一種棘球蚴，其核苷酸序列與已知棘球絳蟲的核苷酸序列差異十分明顯，并根據(jù)該蟲在形態(tài)學和分子生物學等方面的特征首次將其命名為石渠棘球絳蟲。在此之前，由于其在形態(tài)上與多房棘球絳蟲極其相似，一度認為是多房棘球絳蟲的變異種，目前尚未發(fā)現(xiàn)石渠棘球絳蟲感染人的病例。自1996年，Lightowlers等[5]首次在細粒棘球絳蟲(新西蘭羊株)六鉤蚴cDNA文庫篩選出6個克隆，免疫羊時發(fā)現(xiàn)6個克隆中保護效力最好的是EG95融合蛋白(保護率達96%～100%)以來，世界各地學者都進行EG95蛋白免疫保護性試驗，均取得了理想的效果。而ES95作為EG95的同源蛋白，兩者無論是氨基酸序列還是基因編碼序列均具有很高的相似性，因此，筆者通過對ES95蛋白生物信息學分析，驗證 ES95蛋白在預防包蟲病上是否具有很大的潛力。

1材料與方法

1.1試驗材料感染了石渠棘球絳蟲的高原鼠兔采集于青海省果洛藏族自治州久治縣哇爾依鄉(xiāng)(100°20′～101°47′ E，33°02′～34°03′ N)；石渠棘球絳蟲全基因組DNA于高原鼠兔肺臟上的石渠棘球蚴包囊中提??；全基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；T-Vector pMD18克隆載體購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1引物設(shè)計。從NCBI上下載6種棘球?qū)俳{蟲95基因序列，這6種棘球?qū)俳{蟲分別為E.granulosus(EU595909)、E.multilocularis(EU595927)、E.canadensis(EU595920)、E.oligarthrus(EU595938)、E.equinus(EU595921)和E.ortleppi(EU595913)，設(shè)計引物并送金唯智生物(北京)有限公司進行合成。

引物序列為ES95-F：5′ GAAGATGGCATTCCAGTTATGTCTC 3′，ES95-R：5′ GTTCAAGTAAGGACAACCACTATGC 3′。

1.2.2PCR擴增，將石渠棘球蚴包囊于液氮內(nèi)迅速冷凍后研成粉末，按DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，然后按如下體系及程序進行PCR擴增，擴增體系為：2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μl，上下游引物各0.5 μl(25 μmol/L)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)2 μl，加滅菌去離子水補至50 μl。

反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化后，連接到T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α內(nèi)，PCR鑒定為陽性結(jié)果后送北京金唯智生物有限公司進行測序。

1.2.3生物信息學分析。 通過蛋白分析服務器ExPASY(http：//ca.expasy.org/)在線軟件ProtParam(http：//web.exp asy.org/protparam/)和Proscale(http：//web.expasy.org/protscale/)對EM95的基本理化性質(zhì)進行分析。

利用在線軟件SignalP 4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白質(zhì)信號肽進行預測；利用在線軟件TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對EM95跨膜區(qū)進行預測。

通過蛋白分析服務器ExPASY在線軟件PredictProtein(https：//www.predictprotein.org/)預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

利用CBS平臺上的BepiPred 1.0b(http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)和DNAStar兩者結(jié)合方式預測抗原表位。

2結(jié)果與分析

2.1石渠棘球絳蟲Es95基因的克隆以Es95基因特異性引物進行擴增，用1%瓊脂糖進行電泳，結(jié)果得到1 330 bp的特異性條帶，與預期大小一致，證明已成功擴增到該基因(圖1)。

2.2石渠棘球絳蟲Es95基因結(jié)構(gòu)通過與Eg95、Em95序列比對Es95基因有3個外顯子和2個內(nèi)含子，利用MotifScan在線軟件預測出ES95蛋白全長為156個氨基酸，含有1個糖基化位點(圖2)。

2.3Es95基因的理化性質(zhì)ES95蛋白由20種氨基酸組成，其中，Leu含量最多(12.8%)，His和Trp含量最少(0.6%)。ES95蛋白的理論分子質(zhì)量為17.11 ku，等電點為8.58，帶電荷殘基30個，其中負電荷殘基14個(8.97%)，正電荷殘基16個(10.26%)。原子組成為C768H1245N207O197S7。不穩(wěn)定系數(shù)為34.39，證明該蛋白質(zhì)相對較為穩(wěn)定。蛋白在哺乳動物網(wǎng)狀細胞體外培養(yǎng)中表達的半衰期為30 h，在酵母中表達的半衰期大于20 h，在大腸桿菌中表達的半衰期大于10 h。脂肪族氨基酸指數(shù)為97.50，總平均親水性為0.146，蛋白總體親水性較低。

2.4ES95信號肽及跨膜區(qū)預測ES95長為156個氨基酸，既含有信號肽序列又包括跨膜區(qū)。其中第1～16個氨基酸為信號肽序列，第1～132個氨基酸為胞外區(qū)，第133～156個氨基酸為跨膜區(qū)(圖3)。

2.5ES95二級結(jié)構(gòu)分析通過對該ES95蛋白二級結(jié)構(gòu)的預測，結(jié)果顯示，二級結(jié)構(gòu)中柔性結(jié)構(gòu)占氨基酸總數(shù)的51.29%，其中α-螺旋(H)和β-折疊(E)分別占8.33%和43.59%，無規(guī)則卷曲(L)占48.08%(圖4)。

2.6抗原表位預測BepiPred 1.0b預測的ES95蛋白具有抗原性的抗原表位有：第19～32位，第59位，第69～77位，第94位，第96～97位，第121～134位，第137～138位。而用DNAStar所預測的具有抗原性的抗原表位有：第17～36位，第57～65位，第68～82位，第92～101位，第103～113位，第116～133位(圖5)。綜合兩者分析，確定ES95蛋白B細胞抗原表位有：第19～32位，第69～77位，第96～97位，第121～133位。

3結(jié)論與討論

Es95基因全長1 330 bp，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子，兩端外顯子較短，而中間外顯子較長，編碼區(qū)長471 bp，編碼156個氨基酸。ES95蛋白是石渠棘球絳蟲重要的保護性抗原，在六鉤蚴鉆出腸壁時起重要作用。隨著分子生物學技術(shù)及計算機的發(fā)展，生物信息學技術(shù)廣泛應用，利用計算機輔助疫苗設(shè)計技術(shù)得以飛速發(fā)展。利用一些在線或者是本地的生物信息學軟件對基因或蛋白序列進行分析，不僅可以清楚地表明蛋白的基本性質(zhì)，而且很直觀地得到該蛋白的特殊結(jié)構(gòu)，為蛋白是否有成為疫苗分子的潛力或者怎樣設(shè)計才能具有更好的免疫效果提供了便利條件，而且操作簡單、迅速、直觀。Hoop等[6]在1981年提出了用蛋白質(zhì)親水性參數(shù)預測抗原表位的方案，推動了B細胞抗原表位的研究。1985年，Karplus等[7]為進一步提高抗原表位預測的準確性，提出了蛋白質(zhì)柔韌性區(qū)域的預測，認為蛋白質(zhì)骨架具有一定的活動性，其活動性強弱可以預測抗原表位。隨后，Jameson等[8]提出的氨基酸殘基統(tǒng)計分析和以隱馬爾科夫模型建立的抗原表位預測方法都能很好地預測抗原表位，而多種方法相結(jié)合可以使預測結(jié)果更加準確。

該研究從多房棘球絳蟲的幼蟲多房棘球蚴全基因組中擴增出Es95完整的編碼基因，并對其生物信息學特性進行預測與分析。將測序結(jié)果與NCBI上Eg95和Em95序列比對發(fā)現(xiàn)三者相似性很高。預測的ES95分子質(zhì)量與EM95大小相似，比EG95略大一些，分子質(zhì)量約為17.1 ku，有一個糖基化位點，糖基化是真核生物在蛋白翻譯后一種重要的修飾方式。ES95、EG95和EM95三者理化性質(zhì)非常相似，均在N端有一個長為16個氨基酸的信號肽序列，在C端具有一個長為23個氨基酸的跨膜區(qū)，堿性蛋白質(zhì)，其中EM95蛋白的堿性最強，親水性都較低。對其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析可以看出α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例較低，主要是以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。結(jié)合BepiPred 和DNAStar兩者對B細胞抗原表位分析發(fā)現(xiàn)，ES95含有4個抗原表位，而李玉嬌等[9]對EG95抗原表位預測分析發(fā)現(xiàn)EG95可能存在7個B細胞抗原表位(第16～38位，第41～48位，第50～67位，第68～90位，第92～100位，第103～113位，第120～132位)，范彥雷等[10]對EM95抗原表位預測分析發(fā)現(xiàn)EM95可能存在6個B細胞抗原表位(第17～35位，第42～64位，第69～90位，第92～100位，第105～121位，第124～139位)，從上述結(jié)果來看，ES95蛋白的抗原表位與EM95和EG95相差較大，但用BepiPred軟件預測EG95、EM95抗原表位的結(jié)果與上述結(jié)果有所差別，EG95潛在的抗原表位只有5個，分別為第20～32位，第41～44位，第69～77位，第82～86位，第120～134位，而EM95潛在的抗原表位則有6個，分別為第19～21位，第25～33位，第69～77位，第81～86位，第107～111位，第127～134位。這種預測方式則使ES95與EG95、EM95預測結(jié)果相差不大，主要是第41～44位和第82～86位的差別，但無論哪種結(jié)果EG95和EM95抗原表位所包含的氨基酸數(shù)比ES95要多。這種差別可能會使得ES95在抗原動物保護力上要低于EG95和EM95，而且氨基酸殘基極性與非極性的替換也會給蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)造成很大的影響。該研究對石渠棘球絳蟲Es95基因進行了分析，為進一步研究石渠棘球蚴的生物學功能、開發(fā)理想的ES95抗原疫苗奠定了理論基礎(chǔ)。

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摘要[目的]首次克隆獲得石渠棘球絳蟲Es95基因，并進行序列分析，為研究抗包蟲病候選疫苗提供理論指導。[方法]從高原鼠兔肺臟包囊上獲得石渠棘球絳蟲原頭蚴，提取全基因組，并根據(jù)NCBI上6種棘球?qū)俳{蟲95基因序列設(shè)計引物，以基因組DNA為模板擴增到Es95基因，并克隆到T載體上，測序后進行序列分析。[結(jié)果]以石渠棘球絳蟲全基因組DNA為模板擴增出Es95基因長為1 330 bp，序列分析含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，有1個糖基化位點，N端有一信號肽序列(16個氨基酸)，C端有跨膜區(qū)(23個氨基酸)，親水性低，B細胞抗原表位預測有ES95潛在抗原表位6個。[結(jié)論]ES95是一個分泌性糖蛋白，在包蟲病的預防上具有重要意義。

關(guān)鍵詞石渠棘球絳蟲；ES95蛋白；序列分析

Cloning and Sequence Analysis ofEs95 Gene fromEchinococcusshiquicus

LI Jian-qiu, LI Li, YAN Hong-bin, JIA Wan-zhong*et al(State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, CAAS, Lanzhou, Gansu 730046)

Abstract[Objective] The Es95 gene was cloned from E. shiquicus, the sequence analysis was conducted, which will provide theoretical guidance for candidate vaccine in anti-Echinococcosis. [Method] 6 nucleotide sequences of Echinococcus 95 genes download from NCBI were used as reference sequence for designing primers and then was amplified with PCR from total DNA as the template. The Es95 was cloned into vector T and sequenced. [Result] After sequenced, it was found that the length of complete Es95 gene was 1 330 bp, bioinformatic software was used for analyzing the ORF of Es95 and found that it had 3 exons and 2 introns. ES95 was a secreted protein, with one glycosylate sites, a 16-residue signal peptide in N-terminal and a 23-residue trans-membrane region. The analysis of B-cell eptitopes indicated that the ES95 has 6 potential antigen eptitopes. [Conclusion] ES95 was a secreted protein, with one glycosylate sites, it may played a great role in anti-Echinococcosis.

Key wordsEchinococcus shiquicus; ES95 protein; Sequence analysis

收稿日期2015-04-30

作者簡介李建秋(1989- )，女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：人獸共患病及公共衛(wèi)生學。*

通訊作者，研究員，博士，博士生導師，從事人獸共患病及公共衛(wèi)生學研究。

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-033-04