李冉陽， 秦玉濤， 張 倩， 吳 婧， 謝 皓， 郭 蓓,3*　(.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 006；.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京 006；3.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 006)

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大豆GmAGL8基因的克隆及生物信息學(xué)分析

李冉陽1， 秦玉濤1， 張 倩2， 吳 婧2， 謝 皓1， 郭 蓓2,3*(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；3.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

炸莢是大豆的一種自然屬性，也是大豆生產(chǎn)中的一種不良現(xiàn)象，嚴(yán)重影響大豆收獲產(chǎn)量。印度學(xué)者報(bào)道，在熱帶或亞熱帶地區(qū)，大豆易炸莢品種和中度炸莢品種的產(chǎn)量損失分別達(dá)57～175和0～186 kg/hm2[1]，國內(nèi)學(xué)者研究表明，中度炸莢品種的產(chǎn)量損失約為112.5 kg/hm2[2]; 相關(guān)研究者也指出野生型及小粒大豆的炸莢現(xiàn)象尤為普遍[3-5]。世界范圍內(nèi)由于作物種皮開裂造成的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量損失很嚴(yán)重，因此控制種皮開裂對于提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量具有重要意義。

莢果 (pod)是由子房發(fā)育而來的果實(shí)，由通過背縫線和腹縫線相互連接的2個單心皮組成。大豆豆莢是莢果的一種。成熟的大豆莢沿著莢背縫線和腹縫線裂開，隨后散出種子的現(xiàn)象稱為炸莢(pod-shattering)[6]。當(dāng)莢果的水分含量相對較低時，莢內(nèi)生厚壁組織層細(xì)胞的張力不同，莢皮圍繞著與內(nèi)生后壁組織層的纖維方向平行的軸呈螺旋的扭轉(zhuǎn)而卷曲，將連接背、腹縫線的薄壁組織拉裂，莢皮開裂[6-7]。

AGL8也被稱作AGAMOUS-like8，F(xiàn)RUITFULL，F(xiàn)UL等。前人分別對擬南芥和桃中的相關(guān)基因進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，AGL8 基因既調(diào)控分裂組織的分化，又在隨后的心皮發(fā)育中起調(diào)控作用[8-9]。根據(jù)前人研究，擬南芥FUL基因有影響擬南芥開花時間，維持花序分生組織特異性，控制花器官的發(fā)生、心皮的發(fā)育、角果的伸長等功能。在FUL眾多作用中，最受關(guān)注的是FUL控制擬南芥角果果莢開裂的作用，過表達(dá)FUL導(dǎo)致其成熟角果的果莢不開裂[10]。這種表型對于許多農(nóng)作物特別是十字花科植物，很有借鑒意義和應(yīng)用價(jià)值。徐勇等[11]從桃樹(Prunuspersica) 中克隆出與FUL同源的基因PpMADS6，研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的PpMADS6使擬南芥花期提前，單花器官數(shù)目增多 (如花瓣、心皮、雄蕊均有增多)，出現(xiàn)頂端花和多果莢角果在成熟期不開裂等性狀。且過表達(dá)的PpMADS6使擬南芥果莢不開裂，暗示它與FUL行使相同功能，控制角果裂合處細(xì)胞的木質(zhì)化，影響種皮開裂[11]。

筆者對大豆GmAG48基因的克隆及生物信息學(xué)進(jìn)行分析，以期能夠獲得大豆中與炸莢相關(guān)的基因。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料植物材料為大豆品種中黃10，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，北京農(nóng)學(xué)院功能基因發(fā)掘與系統(tǒng)生物工程實(shí)驗(yàn)室繁育?？寺≥d體為pUC-T(康為世紀(jì)生物科技有限公司)。大腸桿菌菌株DH5α為北京農(nóng)學(xué)院功能基因發(fā)掘與系統(tǒng)生物工程室留存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，利用擬南芥角果開裂FUL基因及桃的PpMADS6基因，在大豆基因組中找到與之同源性高的GmAGL8基因(735 bp)。根據(jù)GmAGL8的mRNA序列，設(shè)計(jì)引物GmAGL8-F: 5′-GGAATTCCATGGGGAGAGGAAGGGTGC-3′;GmAGL8-R: 5′-GGGGTACCCCTATTCATTTGTAGGACGAAG-3′。

1.2.2目的基因的克隆。用Trizol法提取大豆中黃10的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收連接到pUC-T載體上，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α后進(jìn)行序列測定。

1.2.3GmAGL8的生物信息學(xué)分析。在NCBI上將GmAGL8與其他物種進(jìn)行同源性比對，使用DNAMAN構(gòu)建進(jìn)化樹。分析GmAGL8基因的CDS。利用ExPASy進(jìn)行氨基酸分子量、等電點(diǎn)計(jì)算。通過ProtParam軟件，對GmAGL8基因編碼的氨基酸組成進(jìn)行分析。利用Protscale在線軟件，對GmAGL8基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因的克隆以大豆中黃10的cDNA為模板，以GmAGL8-F和GmAGL8-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條特異性的PCR擴(kuò)增條帶，其中1、3、4號樣品條帶與預(yù)期擴(kuò)增條帶(735 bp)大小一致(圖1)。選取3號PCR產(chǎn)物與T載體連接為GmAGL8-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過菌落PCR鑒定出陽性克隆后進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果顯示，克隆片段與GenBank上GmAGL8序列的相似度為99.86%，在735個堿基中有734個堿基序列完全相同，只在第549 bp處產(chǎn)生差錯，A堿基錯配成G堿基，但翻譯產(chǎn)物沒有變化，仍為丙氨酸。

2.2GmAGL8的生物信息學(xué)分析

2.2.1PpMADS6和FUL與大豆GmAGL8的比對。將桃中的PpMADS6和擬南芥中的FUL分別與大豆基因組上的GmAGL8進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，大豆中的GmAGL8序列與擬南芥中的FUL相似度為77%，與桃中的PpMADS6相似度為80%。3個基因之間的氨基酸序列同源性為74%(圖2)。研究表明PpMADS6與FUL同屬于MADS box基因家族，對果實(shí)成熟及花器官發(fā)育起著調(diào)控作用，在擬南芥中有控制角果開裂的功能，由此推測，大豆中的GmAGL8也應(yīng)該與豆莢開裂有關(guān)。

2.2.2基因進(jìn)化分析。將GmAGL8在NCBI中進(jìn)行Blast，找到與GmAGL8具有一定相似度的序列，從中挑選出相似值較高的比對序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行基因多重序列比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，大豆與菜豆、田青、鷹嘴豆及豌豆的進(jìn)化關(guān)系比較密切，其中與菜豆的相似度最高。

2.2.3GmAGL8的氨基酸序列分析。大豆GmAGL8基因的735個堿基共編碼244個氨基酸。通過ExPASy軟件對其編碼的氨基酸進(jìn)行分子量及等電點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，GmAGL8編碼的氨基酸等電點(diǎn)(pl)的理論計(jì)算值為9.21，分子量(Mw)的理論計(jì)算值為27999.95。

利用ProtParam軟件對GmAGL8基因編碼的氨基酸組成進(jìn)行了分析，其中含量最高的為亮氨酸(Leu)占12.3%，其次是谷氨酸(Glu)10.2%，賴氨酸(Lys)9.0%，谷氨酰胺(Gln)和絲氨酸(Ser)均占7.4%，精氨酸(Arg)7.0%，丙氨酸(Ala)6.6%，天冬酰胺(Asn)5.3%,，蘇氨酸(Thr)和異亮氨酸(Ile)各占4.9%，甘氨酸(Gly)和纈氨酸(Val)均占4.1%，脯氨酸(Pro)3.7%，天冬氨酸(Asp)3.3%，組氨酸(His)2.5%，酪氨酸(Tyr)和蛋氨酸(Met)均占2.0%，苯丙氨酸(Phe)1.6%，含量最少的為半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)各占0.8%，不含半胱氨酸(Sec)和吡咯賴氨酸(Pyl)。負(fù)電荷總數(shù)為33，正電荷總數(shù)為39，是一種帶2個正電荷的蛋白。在原子組成方面，按所占比例依次為C∶1220、H∶2004、O∶377、N∶362、S∶7，原子總量為3 970。

2.2.4親疏水性分析。使用ExPASy的Protscale在線軟件，采用Kyte & Doolittle 算法對GmAGL8基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果見圖4，疏水性最大峰值出現(xiàn)在第45個氨基酸上，峰值為2.089。親水性最大峰值出現(xiàn)在第141個氨基酸上，峰值為-2.589。氨基酸在親水性區(qū)域所占比重遠(yuǎn)大于疏水性區(qū)域，預(yù)測GmAGL8基因編碼的蛋白為親水性蛋白。

2.2.5GmAGL8的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由圖5可知，GmAGL8的CDS全長為735 bp。通過對其CDS區(qū)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，第2～79個氨基酸編碼一個與MADS具有相似功能的MEF2結(jié)構(gòu)，推測其中第2～38個堿基處含有DNA結(jié)合位點(diǎn)，長度為37 bp；且在第59個氨基酸處還含有推測的磷酸化位點(diǎn)；在第21～74個氨基酸處含有多肽結(jié)合位點(diǎn)；在第75～167個氨基酸中間存在一個K-box基因，長度為93 bp，呈卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)，K-box與SRF-type轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)系，很可能對多聚體的形成存在影響。

3結(jié)論與討論

根據(jù)前人研究的結(jié)果，分別在擬南芥和桃中找到了控制果莢裂合的2個基因FUL和PpMADS6。利用NCBI將這2個基因分別與大豆基因組進(jìn)行比對，結(jié)果在大豆基因組中查找到一個相似性較高的基因GmAGL8，其與擬南芥FUL基因相似度為77%，與桃的PpMADS6基因相似度為80%。研究表明，F(xiàn)UL和PpMADS6都有控制擬南芥角果果莢開裂的作用，當(dāng)該基因過表達(dá)時，擬南芥角果果莢變短且成熟時不易開裂。由此推測，大豆中的GmAGL8基因或許是控制大豆豆莢開裂與否的有效基因之一。

此外，對GmAGL8基因進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GmAGL8中含有一個K-box基因功能區(qū)，推斷其與多聚體的形成有關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)，存在與MADS基因功能相似的MEF2。MADS-box基因家族有控制植物花器官分化、果莢裂合的功能，或許GmAGL8對大豆花和果實(shí)的發(fā)育也存在調(diào)控作用，且推斷在第2～79 bp處基因編碼的蛋白可能承擔(dān)該功能。這些推測需要后續(xù)的試驗(yàn)加以證實(shí)。

通過親疏水性分析發(fā)現(xiàn)GmAGL8基因編碼的氨基酸多為親水性氨基酸，其中含量最高的為亮氨酸(Leu)，含量最低的為半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)，且不含半胱氨酸(Sec)和吡咯賴氨酸(Pyl)。

通過基因多重序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，大豆與菜豆、田青、鷹嘴豆及豌豆的進(jìn)化關(guān)系比較密切，其中與菜豆的相似度最高。

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摘要通過同源擴(kuò)增從大豆中克隆得到與擬南芥AGL8基因相似的基因GmAGL8，并對該序列進(jìn)行了測定。同時對GmAGL8進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過比對GmAGL8與桃PpMADS6和擬南芥FUL的核酸序列，相似度分別為80%和77%，三者的氨基酸序列同源性為74%。通過親疏水性分析預(yù)測GmAGL8基因編碼的蛋白為親水性蛋白。在GmAGL8中發(fā)現(xiàn)與MADS基因家族相似的MEF2并找到可能對多聚體的形成有關(guān)的K-box基因。

關(guān)鍵詞大豆；GmAGL8； 炸莢；克??；生物信息學(xué)

Cloning and Bioinformatics Analysis of GeneGmAGL8 in Soybean

LI Ran-yang1, QIN Yu-tao1, ZHANG Qian2, GUO Bei2,3*et al(1. College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 2. College of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 3. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing 102206)

AbstractBy comparing nucleotide sequences of GmAGL8 with peach PpMADS6 and arabidopsis FUL, similarity were 80% and 77% respectively, their amino acid sequences homology of 74%. GmAGL8 gene encoding proteins is hydrophilic proteins. In soybean GmAGL8, it was found a structure named MEF2 which is similar to MADS gene families and a gene named K-box might be in the formation of polymer.

Key wordsSoybean; GmAGL8; Pod-shattering; Cloning; Bioinformatics

收稿日期2015-04-30

通訊作者

作者簡介李冉陽(1990- )，女，碩士研究生，研究方向：大豆分子遺傳育種。*，教授，從事植物分子遺傳育種研究。

基金項(xiàng)目國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2012AA101106)。

中圖分類號S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-045-04