鄭慧敏，毛培勝，黃鶯

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，草業(yè)科學北京市重點實驗室，北京 100193)

老芒麥染色體組型分析

鄭慧敏，毛培勝*，黃鶯

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，草業(yè)科學北京市重點實驗室，北京 100193)

摘要：以老芒麥種子為材料，利用酶解-火焰干燥法來分析有絲分裂中期染色體核型，為老芒麥系統(tǒng)分類及育種工作提供科學依據(jù)。研究結果表明，老芒麥染色體數(shù)目為28條，13號染色體上有1對隨體，臂比值大于2的染色體占7.14%，最長染色體與最短染色體比值為2.04，核型公式是2n=4x=28=24m+4sm(2SAT)，不對稱類型為2B。細胞有絲分裂呈現(xiàn)出間期、前期、前中期、中期、后期5個不同的時期。在分裂間期，細胞核染色均勻；到分裂前期時可以看到纖細狀的網(wǎng)狀染色體；進入分裂前中期，可辨別單個染色體；到分裂中期，染色體高度濃縮，姊妹染色單體及著絲點都清晰可辨；在分裂后期，姊妹染色單體分離。

關鍵詞：老芒麥；核型；有絲分裂

DOI：10.11686/cyxb2014371http://cyxb.lzu.edu.cn

鄭慧敏，毛培勝，黃鶯. 老芒麥染色體組型分析. 草業(yè)學報, 2015, 24(8): 225-230.

Zheng H M, Mao P S, Huang Y. Karyotype analysis and mitotic observation ofElymussibiricus. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 225-230.

收稿日期：2014-09-02；改回日期：2014-10-27

基金項目：十二·五科技支撐課題(2011BAD17B01-02)和草業(yè)科學北京市重點實驗室共建項目資助。

作者簡介：鄭慧敏(1991-)，女，山東菏澤人，在讀碩士。E-mail: zhenghuimin5210@163.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail: maops@cau.edu.cn

Karyotype analysis and mitotic observation ofElymussibiricus

ZHENG Hui-Min, MAO Pei-Sheng*, HUANG Ying

DepartmentofGrasslandScience,CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity；BeijingKeyLaboratoryofGrasslandScience,Beijing100193,China

Abstract:A study has been undertaken to determine the karyotype of Elymus sibiricus. The results showed that the chromosome number of E. sibiricus was 28, with a pair of satellites on the short arms of the 13thchromosomes. Its karyotype figure is 2n=4x=24m+4sm (2SAT). The percentage of chromosomes with arm ratios over 2 was 7.14%, and the ratio of the longest to the shortest was 2.04. Its karyotype asymmetry is 2B. There were five phases (Interphase, Prophase, Prometaphase, Metaphase and Anaphase) in the process of mitosis. At interphase the nuclei were dyed homogeneously. During prophase the shape of the slender chromosomes was visible. The individual chromosome could be identified clearly in the prometaphase. At metaphase the chromosomes highly concentrated and the chromatids and centromeres were distinctly visible. During anaphase the chromatids separated and moved to the opposite poles.

Key words:Elymus sibiricus; karyotype; mitosis

老芒麥(Elymussibiricus)屬于小麥族禾本科披堿草屬多年生疏叢型草本植物，具有抗旱、抗寒、耐鹽堿及分蘗能力強等特點，大面積應用于天然草地的恢復和人工草地的建植中[1-2]。老芒麥營養(yǎng)物質豐富、適口性好、產(chǎn)量高，是一種適合家畜食用的優(yōu)良禾草[3]。

部分老芒麥具有抗小麥花葉病和抗大麥銹病等一些優(yōu)良基因，可以通過雜交和轉基因工程將這些基因轉入小麥族近緣種中，進而增強被轉入基因物種的抗病蟲害特性[4]。云錦鳳等[5]通過分析雜交后代染色體，探討了親本的同源性及雜種優(yōu)勢的利用。李景環(huán)等[6]通過比較親本與子代的染色體組型及子代花粉母細胞減數(shù)分裂行為，鑒定了老芒麥與加拿大披堿草(Elymuscanadensis)雜交后代F1的真?zhèn)涡院筒挥龣C理。對老芒麥與近緣種染色體同源性關系的深入研究，可以為育種工作提供大量的有用信息[7]。有絲分裂前期染色質細長，DNA伸展性較好，暴露的堿基對較多，該時期有利于引物原位雜交新技術探測基因位點[8]。因此，對老芒麥進行核型分析及有絲分裂的觀察可以為遺傳學、染色體工程及細胞分類學等技術應用提供科學依據(jù)。

我國學者已在老芒麥品種選育、抗性、生產(chǎn)性能、生理特征等方面開展了相關的研究[9-12]。但是，對于老芒麥的細胞學研究報道較少，并且結果不統(tǒng)一，爭議性較大。陳仕勇等[13]研究提出老芒麥的核型公式為2n=4x=28=22m+6sm(2SAT)，核型對稱性類型為2A。王琴等[14]報道的老芒麥核型公式為2n=4x=28=24m(2SAT)+4sm，核型對稱性類型為2B。因此，對老芒麥染色體組型的確定有待進一步研究。

我國老芒麥野生資源豐富，廣泛分布于內蒙古、青海、甘肅等地，但是對該資源的搜集及育種工作都較為滯后，到2014年我國僅有8個國家審定品種。針對老芒麥進行核型分析，可以加速該資源的鑒定、保存及利用，為育種工作提供理論基礎。故本實驗以老芒麥為研究對象，利用酶解-火焰干燥法進行染色體制片，分析核型并觀察有絲分裂過程，為老芒麥在披堿草屬中的進化分類學地位、雜交育種研究等方面提供細胞學依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

實驗材料為老芒麥種子，種子于2013年采集于河北省承德市魚兒山牧場，由中國農(nóng)業(yè)大學牧草種子實驗室提供。

1.2　染色體制片

按照牧草種子檢驗規(guī)程GT/T2930.4-2001的規(guī)定，設置老芒麥的生根環(huán)境[15]。待根尖長到0.5~2.0 cm時，于培養(yǎng)箱中光照2~3 h后取材，選擇生長良好的種子，剪取粗壯正常的根尖0.5 cm左右。將根尖放入2 mmol/L的8-羥基喹啉中，20~25℃條件下預處理4 h，期間更換一次處理液。而后進行固定，先用蒸餾水清洗處理過的根尖至少3次，再置入卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)中，4℃條件下固定20~21 h。再將根尖放在0.075 mol/L KCl溶液中，前低滲處理30 min。用蒸餾水充分洗凈根尖3次，置于有混合酶液(2.5%纖維素酶+1.25%果膠酶)的小培養(yǎng)皿內，20~25℃下酶解2 h 15 min，酶解過程中最好輕輕搖動小培養(yǎng)皿幾次，促使酶解反應更加充分。用蒸餾水慢慢沖洗根尖3次，注意完全去除酶解液，再放入蒸餾水中浸泡15 min，完成后低滲過程。進行火焰干燥，清潔載玻片上放上3~5個乳白色根尖，加一滴固定液，迅速用鑷子將材料搗碎，將載玻片一端抬起輕輕吹氣，使細胞分散成薄薄的一層，將制片在酒精燈上干燥。1%的吉姆薩染液滴在制片上2 h，之后用蒸餾水清洗3遍，晾干。最后鏡檢，制好的臨時玻片在生物顯微鏡(OLYMPUS BX53，日本株式會社)下觀察并拍照。

1.3　核型分析

參考李懋學和陳瑞陽[16]提出的標準，選取102個染色體分散良好的有絲分裂細胞，統(tǒng)計細胞的染色體數(shù)目。選取5個清晰的有絲分裂中期細胞，計算核型的各個參數(shù)指標，即：

染色體相對長度(%)=染色體個體長度/染色體組總長度×100

臂比=長臂/短臂

染色體長度系數(shù)=染色體個體長度/全組染色體平均長度

染色體長度比=最長染色體長度/最短染色體長度

利用SPOT Isight 4.0軟件分別測量染色體的長臂與短臂，利用Excel計算出染色體的相對長度、臂比以及染色體長度系數(shù)等一系列核型參數(shù)。參考Stebbins[17]的核型分類原則，根據(jù)染色體長度比和臂比確定核型的不對稱性程度。選取具有代表性照片一張，根據(jù)核型分析結果，利用VideoTesT-Karyo3.1核型分析軟件剪貼染色體，配對制成核型圖。繪制出便于觀察分析的核型模式圖。

1.4　有絲分裂過程觀察

根據(jù)高等植物有絲分裂各個時期的特點[18-20]，觀察老芒麥染色體有絲分裂不同時期的細胞，利用生物顯微鏡(OLYMPUS BX53，日本株式會社)拍照分析。

2結果與分析

2.1　老芒麥根尖染色體數(shù)目的確定

根據(jù)根尖細胞染色體觀察結果，染色體數(shù)目在14~56間(表1)。78.43%的細胞染色體數(shù)目為28條，染色體數(shù)目變化范圍在24~29之間，并有少量單倍體和多倍體變異細胞的出現(xiàn)。據(jù)此認為老芒麥的染色體數(shù)目為28，即2n=28。在染色體數(shù)目為28的80個細胞中，發(fā)現(xiàn)具有1對隨體的細胞77個，所占比例為96%，因此確定老芒麥染色體組含有1對隨體染色體。

表1　老芒麥根尖細胞染色體數(shù)目

2.2　核型分析

老芒麥根尖細胞染色體核型分析結果表明(圖1、表2)，染色體相對長度變化范圍是4.78%~9.73%，由12對中部著絲點區(qū)(m)和2對亞中部著絲點區(qū)(sm)染色體組成，具有1對隨體，位于第13號染色體的短臂上，除第5對和第13對染色體為亞中部著絲點區(qū)(sm)，其余均為中部著絲點區(qū)(m)染色體，其核型公式為2n=4x=24m+4sm(2SAT)。臂比大于2的染色體占染色體總數(shù)的7.14%，染色體長度比為2.04。根據(jù)Stebbins[17]的核型分類標準，老芒麥的染色體核型類型為2B，屬于較為對稱型品種(圖2)。

圖1　老芒麥染色體組型Fig.1　Karyotype of E. sibiricus

圖2　老芒麥核型模式Fig.2　Idiogram of E. sibiricus

2.3　染色體的有絲分裂過程

根據(jù)老芒麥根尖細胞染色體有絲分裂觀察結果，染色體有絲分裂包括間期、前期、前中期、中期和后期(圖3)。間期細胞核染色較為均勻，看不到染色質絲(圖3a)。前期隱約可見松散的染色體(圖3b)。進入前中期后，染色體進一步縮短變粗，并且單個染色體逐漸變得清晰，但是無法清晰辨別著絲點和姊妹染色單體(圖3c)。

在有絲分裂中期，染色體高度螺旋化，著絲點和姊妹染色單體都清晰可見(圖3d)。細胞有絲分裂中期染色體本應排列于赤道板中，但是本實驗觀察到的染色體都凌亂地分布在一個小的區(qū)域中，這是由于8-羥基喹啉的作用，妨礙了紡錘絲的形成，使染色體無法正常移動到赤道板上。細胞分裂后期，姊妹染色單體分離，但是實驗觀察到的染色體沒有明顯的移向兩極的趨勢(圖3e)，可能是試劑處理影響了紡錘絲的作用。

表2　老芒麥核型分析參數(shù)

m：中部著絲點區(qū)Median region；sm：近中部著絲點區(qū)Submedian region；* 帶有隨體的染色體，隨體不計入臂長Chromosome has satellite and satellite were not summed up to the arm length.

圖3　老芒麥有絲分裂過程

3討論

3.1　染色體數(shù)目

本實驗中老芒麥染色體數(shù)目存在多個變量。在24~26之間的變化可能包含兩個原因，一方面是制片時酶解作用使細胞膜崩潰，導致少數(shù)染色體丟失；另一方面是老芒麥在生長期間發(fā)生了染色體數(shù)目的變異，該變異也可能引起染色體數(shù)目的增多，即出現(xiàn)染色體數(shù)目為29的現(xiàn)象。對于二倍(2n=2x=14)體的出現(xiàn)，有待于進一步研究。據(jù)劉玉紅[21]報道我國除老芒麥外，其他多數(shù)披堿草屬植物屬于六倍體。本實驗中，六倍體(2n=6x=42)細胞出現(xiàn)的情況較多，所占比例達到11.7%，可能是提供的材料不純，混雜有其他六倍體的披堿草屬植物。八倍體(2n=8x=56)細胞的存在也可能有兩種原因，一是預處理液有類似于秋水仙素的作用，阻礙了紡錘絲的運動[22]；二是細胞膜崩潰的細胞沒法給紡錘絲提供發(fā)揮作用的環(huán)境，進而使細胞的染色體加倍。由于8-羥基喹啉預處理對紡錘絲的作用機理還沒有較為權威的報道[23]， 因此，對于本實驗中多倍體出現(xiàn)的具體原因還需要進一步探索。

老芒麥核型分析中，染色體數(shù)目為28的細胞所占比例最高，也符合前人的研究結果，因此，本實驗中確定老芒麥的染色體數(shù)目為28[24]。

3.2　染色體組型

我國學者從20世紀80年代就開始了對老芒麥核型的分析，劉玉紅[21]提出老芒麥核型公式為2n=4x=28=24m+4sm(2SAT)，一對隨體位于第7號染色體，核型類別為1A。王琴等[14]提出的老芒麥核型公式為2n=4x=28=24m(2SAT)+4sm，核型對稱性類型為2B。兩者隨體位置和對稱性類型不同。孫義凱等[25]研究認為老芒麥核型公式為2n=4x=28=20m+8sm(4SAT)，兩對隨體分別位于7和14號染色體上，核型類別為2A。陳仕勇等[13]研究提出老芒麥的核型公式為2n=4x=28=22m+6sm(2SAT)，核型對稱性類型為2A。多年來各學者針對老芒麥核型分析提出的結果都有較大差異。本實驗中老芒麥的核型公式為2n=4x=28=24m+4sm(2SAT)，和劉玉紅[21]提出的核型公式相同，但是核型對稱性有差別。

老芒麥核型結果之間的差異性，可能與實驗方法有關，也可能與測量染色體長度時存在的誤差有關。嚴學兵等[26]利用微衛(wèi)星分子標記技術研究提出，老芒麥的遺傳特點和環(huán)境因素(經(jīng)緯度、海拔等)有著密切的關系。鄢家俊等[27]利用RAPD分子標記技術提出，老芒麥的遺傳分化和生態(tài)地理環(huán)境具有一定的相關性。張曉燕等[28]對3份不同來源偃麥草(Elytrigriarepens)種子的核型分析中總結認為，3份材料之間核型都存在一定的差異性，但是染色體數(shù)目和著絲點位置的分布比較穩(wěn)定。因此，老芒麥核型多樣性還可能與材料采集地點有關，核型結果在一定的范圍內是允許存在差異性的。

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