陳釗,梁新平,侯扶江，田苗苗，張紅瑞，余瑩，管永卓，王成章，嚴(yán)學(xué)兵*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

不同放牧強(qiáng)度下垂穗披堿草遺傳多樣性分析

陳釗1,梁新平1,侯扶江2，田苗苗1，張紅瑞1，余瑩1，管永卓1，王成章1，嚴(yán)學(xué)兵1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

摘要：放牧對草地植物種群遺傳與進(jìn)化產(chǎn)生重要影響，本研究利用SSR分子標(biāo)記對4個(gè)不同放牧強(qiáng)度下垂穗披堿草種群遺傳多樣性進(jìn)行研究，試驗(yàn)地選擇在甘肅省甘南自治州瑪曲縣的阿孜試驗(yàn)站，利用8對多態(tài)性強(qiáng)的SSR引物對不同放牧壓力下4個(gè)居群的800個(gè)個(gè)體基因組進(jìn)行檢測，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)在1.2267～1.9976之間。利用popgene分析發(fā)現(xiàn)不放牧垂穗披堿草種群遺傳多樣性最高，在3種不同放牧地，中等放牧強(qiáng)度的遺傳多樣性指數(shù)較高，其次為重牧，最后為輕度放牧。在不同放牧干擾下的4個(gè)垂穗披堿草種群的遺傳分化系數(shù)為0.5168，基因流Nm=0.2337，說明4個(gè)種群的遺傳變異主要發(fā)生在種群之間。從種質(zhì)資源保護(hù)角度來講，不放牧對于垂穗披堿草種質(zhì)資源的保護(hù)是有利的；從草地利用角度，中等放牧強(qiáng)度比較合理。

關(guān)鍵詞：遺傳多樣性；基因流；放牧強(qiáng)度；SSR；披堿草

DOI：10.11686/cyxb2014355http://cyxb.lzu.edu.cn

陳釗,梁新平,侯扶江，田苗苗，張紅瑞，余瑩，管永卓，王成章，嚴(yán)學(xué)兵. 不同放牧強(qiáng)度下垂穗披堿草遺傳多樣性分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(8): 159-165.

Chen Z, Liang X P, Hou F J, Tian M M, Zhang H R, Yu Y, Guan Y Z, Wang C Z, Yan X B. Genetic diversity ofElymusnutansunder different grazing intensities. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 159-165.

收稿日期：2014-08-21；改回日期：2014-12-01

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30901051,31172249)資助。

作者簡介：陳釗(1990-)，男，河南滑縣人，碩士。E-mail:740515547@qq.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail:yxbbjzz@163.com

Genetic diversity ofElymusnutansunder different grazing intensities

CHEN Zhao1, LIANG Xin-Ping1, HOU Fu-Jiang2, TIAN Miao-Miao1, ZHANG Hong-Rui1, YU Ying1, GUAN Yong-Zhuo1, WANG Cheng-Zhang1, YAN Xue-Bing1*

1.CollegeofAnimal&VeterinaryScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China; 2.CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,Lanzhou730020,China

Abstract:Grazing can influence the population genetics and evolution of grassland plant species. To study the relationship between grazing and the potential for evolutionary differentiation and gene flow, we used SSR markers to study the genetic diversity of Elymus nutans. The experiment station investigated is based at Azi, in Maqu County in the Gannan region of Gansu Province. The grazing lands were divided into four levels according to different grazing intensities. Eight pairs of SSR primers were used to detect genetic diversity among 800 individual plants from the four populations under different grazing pressures. The effective number of alleles per locus ranged from 1.2267 to 1.9976. We found that materials under moderate grazing intensity had the highest genetic diversity index, followed by the heavy and then light grazing levels. The genetic differentiation coefficient under different grazing levels is 0.5168. This suggests that genetic variation of the four populations exists mainly among populations. In conclusion, no grazing or enclosure is effective for the conservation of E. nutans genetic resources. For grassland utilization, however, moderate grazing is relatively optimal.

Key words:genetic diversity; gene flow; grazing intensity; SSR; Elymus

草地生態(tài)系統(tǒng)是我國最大的綠色屏障，是生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)，草地對于維護(hù)生態(tài)平衡，改善生態(tài)環(huán)境，以及保護(hù)人類生存和發(fā)展都起著至關(guān)重要的作用[1]。我國草地面積占國土總面積的42%，達(dá)到4億hm2。其中可利用的大約為3億hm2，占國土總面積的1/3。但是近年來由于人們對草原不合理的開發(fā)和利用，導(dǎo)致我國草原已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的退化。其中，不合理的放牧是導(dǎo)致草原退化的主要原因[2]。在相同的氣候條件下，放牧干擾因子對草原植物的影響可以超越不同地段其他環(huán)境條件的影響，成為影響草原植物群落關(guān)系主要影響因子[3]。在放牧過程中，家畜可以通過選擇性采食，直接影響某些甚至是某一類植物的種群結(jié)構(gòu)，從而影響或者改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)[4]。放牧強(qiáng)度還會(huì)影響到牧區(qū)土壤理化性質(zhì)和土壤熱量的流動(dòng)[5]。改變草地群落組成，草地初級(jí)生產(chǎn)力并非隨著放牧強(qiáng)度的增加而線性下降[6]。適當(dāng)?shù)姆拍習(xí)Σ莸卦斐烧娴母蓴_可促進(jìn)草地物種多樣性，加強(qiáng)草地的生產(chǎn)力和群落的穩(wěn)定性[7]。物種多樣性是地球上生物賴以生存的基礎(chǔ)，是生物可以適應(yīng)不同的環(huán)境，不斷進(jìn)化和繁衍的物質(zhì)基礎(chǔ)。種群的遺傳多樣性與種群的進(jìn)化潛力和對環(huán)境的適應(yīng)性有著密切的聯(lián)系。遺傳多樣性是地球上物種多樣性的核心和物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生物多樣性的重要組成部分，更是地球生態(tài)系統(tǒng)中各種群落之間可以不斷進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的核心?，F(xiàn)有的研究多集中在個(gè)體和種群水平上的種群動(dòng)態(tài)和物種功能特征，以及在群落水平上的結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)功能的影響[8-9]。研究物種的遺傳多樣性可以從分子角度對物種的種群變化進(jìn)行深入的探討。

遺傳多樣性的研究伴隨著分子化學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，科學(xué)家可以從不同的層次、不同的角度用不同的技術(shù)對物種的遺傳信息和生物性狀進(jìn)行研究和推測。近年來分子標(biāo)記是較為常見的一種方法。SSR(simple sequence repeat，簡單序列重復(fù))標(biāo)記以其多態(tài)性高，操作方便，數(shù)量豐富和穩(wěn)定性強(qiáng)等眾多優(yōu)點(diǎn)成為一種較為理想的分子標(biāo)記方法。SSR在基因組中較為均勻地分布，容易檢測，在實(shí)驗(yàn)操作過程中進(jìn)行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增時(shí)對模板DNA的要求不高，只要有少量的DNA模板就能進(jìn)行高通量的分析[10]。目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在了多花黑麥草等牧草育種工作中[11]?？梢杂脕斫沂揪尤褐g、品種之間或是個(gè)體之間遺傳的多樣性，重復(fù)性較好，近年來逐漸取代了RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性)，ISSR(inter-simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài))等分子標(biāo)記[12]。

垂穗披堿草 (Elymusnutans)主要分布于我國寧夏，甘肅，新疆，內(nèi)蒙古等省區(qū)，抗寒性強(qiáng)，粗蛋白含量較高，屬于多年生疏叢型優(yōu)質(zhì)牧草[13-14]，是草地群落系統(tǒng)的重要組成部分，有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)意義。本實(shí)驗(yàn)主要利用分子標(biāo)記的手段通過對不同放牧強(qiáng)度下垂穗披堿草種群遺傳多樣性的研究來深入了解放牧與種群進(jìn)化潛力，分化程度及基因流動(dòng)的關(guān)系。為確定合理有效的放牧方式及治理高寒草地的退化提供一定的依據(jù)。

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)地概況及設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)是在甘肅省甘南自治州瑪曲縣的阿孜試驗(yàn)站進(jìn)行。瑪曲縣位于黃河上游，甘肅、四川和青海三省的結(jié)合部，在青藏高原的東北緣。并位于33°06′30″-34°30′15″ N，100°45′45″—102°29′00″ E，海拔3500 m左右。是黃河中下游地區(qū)的天然自然屏障[15]，年降水量約為620 mm，全年的平均日照時(shí)數(shù)為2580 h，1月溫度最低是-8.7℃，7月溫度達(dá)到最高是11.3℃。年均溫僅為1.2℃，≥10℃積溫持續(xù)時(shí)期僅有2個(gè)月多，此地屬于典型高原大陸性氣候。植被屬于高寒草原類型，全縣的草地類型為高寒草甸草地和山地草甸草地[16]。根據(jù)放牧強(qiáng)度的不同，4個(gè)草場進(jìn)行不同強(qiáng)度放牧處理已達(dá)3年，把放牧地分為4種強(qiáng)度的放牧地：封育草地不進(jìn)行放牧作為對照(control，CK)，放牧強(qiáng)度為4只羊/hm2是輕度放牧(light grazing，LG)，放牧強(qiáng)度為8只羊/hm2是中度放牧(medium grazing，MG)，放牧強(qiáng)度為16只羊/hm2是重度放牧(high grazing，HG)，輪牧周期是45 d，放牧期是7 d左右。在每一個(gè)放牧小區(qū)隨機(jī)采收成熟的種子穗80個(gè)(實(shí)驗(yàn)種植40株)，單株的植物距離不小于5 m(防止采集到同一植株不同個(gè)體即克隆單株)，每一個(gè)種子穗放入一個(gè)信封中標(biāo)記，在烘箱中50℃烘干(防止部分種子過潮不利于攜帶)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

將垂穗披堿草種子在烘箱中50~55℃的溫度處理，大約5~6 d的時(shí)間以打破種子的休眠作用。然后將種子種在一次性花盆中，澆水，在未發(fā)芽前以光照25℃18 h，黑暗20℃6 h用光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，種子發(fā)芽后以光照26℃12 h，黑暗20℃12 h進(jìn)行培養(yǎng)。幼苗在1個(gè)月左右時(shí)即可長至兩葉一心，此時(shí)的幼苗就可以用于DNA的提取。

表1　本研究中所用SSR引物序列

本實(shí)驗(yàn)提取垂穗披堿草的基因組用的是經(jīng)過改進(jìn)后的CTAB(cetyltriethy lammoniurn bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法[17]，通過分光光度計(jì)和瓊脂糖跑膠來鑒別提取基因組的純度。將提取的基因組進(jìn)行PCR反映，PCR體系為20 μL體系。模板為1 μL，引物各1 μL，ddH2O為7 μL，mix為10 μL[10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，250 μmol/L DNTP，0.05 U/μL Polymerase]。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，退火溫度在50~55℃之間40 s，72℃延伸30 s，72℃延伸10 min，循環(huán)數(shù)為36。本實(shí)驗(yàn)引物具體信息如表1和表2。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物首先用1%瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物存在，然后再用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。

1.3　數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過銀染后的聚丙烯酰胺膠可以直接在觀片燈下讀取，SSR是共顯性標(biāo)記，可以根據(jù)條帶的類型直接讀出基因型為雜合或者是純合，基因類型用AA，BB，AB來標(biāo)記，形成原始數(shù)據(jù)，每一對等位基因視為一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(圖1)。遺傳多樣性指數(shù)(有效等位基因[18]、Shannon’s信息指數(shù)[19]、有效種群大小、Nei’s指數(shù))及基因流[Nm=Gene flow estimated from Fst=0.25(1-Fst)/Fst]采用Popgene V.1.32進(jìn)行分析。

表2　SSR-PCR位點(diǎn)遺傳多態(tài)性

圖1　部分垂穗披堿草LG組SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PACG gel with results of SSR-PCR bands from LG in different Elymus populations

2結(jié)果與分析

2.1　SSR-PCR擴(kuò)增位點(diǎn)遺傳多樣性分析

種群遺傳多樣性的研究，通常是以Shannon信息指數(shù)，有效等位基因數(shù)等來衡量其水平。本研究通過SSR-PCR的引物篩選試驗(yàn)，挑選出的8對引物共擴(kuò)增出16個(gè)位點(diǎn)，引物ECGT36對應(yīng)A-1到A-3，EAGA104對應(yīng)L-1到L-3，ECGA114對應(yīng)AA-1和AA-2，ECGA22對應(yīng)F-1和F-2，EAGA101對應(yīng)M-1，EAGA13對應(yīng)G-1和G-2，EAGA103對應(yīng)N-1，EAGA104對應(yīng)K-1和K-2。每對引物檢測出的位點(diǎn)數(shù)不同，其中引物ECGT36，EAGA104擴(kuò)增出的位點(diǎn)最多，檢測到3個(gè)位點(diǎn)；EAGA101和EAGA103擴(kuò)增出的位點(diǎn)最少，檢測到1個(gè)位點(diǎn)(圖1)。所有位點(diǎn)的多態(tài)性均為100%，說明實(shí)驗(yàn)材料的遺傳多態(tài)性較為豐富。擴(kuò)增片段的長度在370~1598 bp之間，位點(diǎn)EAGA101的M-1擴(kuò)增片段最大為1598 bp，AA-2(ECGA114)擴(kuò)增片段最小為370 bp。利用8對SSR引物對不同放牧壓力下4個(gè)居群的800個(gè)個(gè)體遺傳多樣性進(jìn)行檢測，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)在1.2267~1.9976之間，其中位點(diǎn)AA-1的有效等位基因數(shù)最高是2.0000，最低的是K-2，為1.0398(表2)。

2.2　遺傳多樣性分析

在不同放牧壓力下的4個(gè)垂穗披堿草居群通過SSR-PCR擴(kuò)增出條帶的多態(tài)性隨著放牧壓力的增大呈下降的趨勢，對照組的多態(tài)性最高為100%，在重度放牧干擾下的垂穗披堿草的位點(diǎn)多態(tài)性比率為43.75%，是4個(gè)居群中最低的一組。有效等位基因數(shù)(Ne)，Nei’s遺傳多樣性(H)和Shannon信息指數(shù)(I)表現(xiàn)出一致性，在不放牧條件下均表現(xiàn)出最高的趨勢，Ne是1.7100，H是0.3919，I是0.5702。在放牧條件下，中度放牧干擾下垂穗披堿草的Shannon信息指數(shù)及有效等位基因數(shù)最高，即在中度放牧條件干擾下的垂穗披堿草種群的進(jìn)化潛力及基因的多樣性都是最高。輕度放牧的有效等位基因數(shù)和Shannon信息指數(shù)是最低的(表3)。與對照組相比，LG組，MG組和HG組的Nei’s遺傳多樣性(H)和Shannon信息指數(shù)(I)分別降低了42.3%，22.0%，23.8%，37.7%，18.6% 和19.4%。在放牧地中，中等放牧強(qiáng)度的遺傳多樣性指數(shù)較高，其次為重牧，最后為輕度放牧。這說明放牧干擾會(huì)明顯地影響到垂穗披堿草的遺傳多樣性，對于垂穗披堿草的進(jìn)化和生存有著較大的干擾作用。不放牧條件下有利于垂穗披堿草遺傳多樣性的維持，在草地放牧條件下，中度放牧對于維持垂穗披堿草的遺傳多樣性是最有利的。

2.3　遺傳相似性和遺傳距離的分析

不同居群間的遺傳距離和遺傳相似性可以反映出各居群間的親緣關(guān)系以及遺傳背景的差異性，遺傳距離和遺傳相似性呈負(fù)相關(guān)性，遺傳距離越大，說明居群間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，遺傳相似性也就越低，反之亦然。由表4可以看出，中度放牧區(qū)和輕度放牧區(qū)的遺傳相似度最大，為0.7901，重度放牧和中度放牧的遺傳相似性最小，為0.5244。輕度放牧和對照組的遺傳相似度是0.7446，重度放牧和對照組的遺傳相似度是0.6913，重度放牧和輕度放牧的遺傳相似系數(shù)是0.5965。重度放牧和對照組的遺傳相似度是0.5544。

在不同放牧強(qiáng)度干擾下的垂穗披堿草，重度放牧和中度放牧的遺傳距離最大，為0.6456，輕度放牧和中度放牧的遺傳距離最小,為0.2356，對照組與輕度放牧的遺傳距離是0.2949，對照組與中度放牧的遺傳距離是0.3691，對照組與重度放牧組的遺傳距離是0.5899，輕度放牧組與重度放牧組的遺傳距離是0.5166。

根據(jù)遺傳距離，對不同放牧壓力下的垂穗披堿草材料的SSR數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建了垂穗披堿草的UPGMA系統(tǒng)樹(圖2)。從聚類分析圖上可以看出，輕度放牧和中度放牧先聚為一類，然后與對照組聚為一類，最后與重度放牧聚為一類。

表3　不同放牧條件下垂穗披堿草的遺傳多樣性指數(shù)

表4　不同放牧強(qiáng)度干擾下垂穗披堿草種群

圖2　不同放牧條件種群的聚類分析Fig.2　Clustering of populations under different grazing intensity

上三角為Nei’s遺傳相似性，下三角為Nei’s遺傳距離。Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance(below diagonal). 2.4遺傳分化系數(shù)和基因流分析

不同放牧壓力下的4個(gè)垂穗披堿草種群間的遺傳分化系數(shù)Fst為51.68%，不同居群總的遺傳分化系數(shù)為0.4018，種群間的基因流為0.2337(表5)。說明種群間的基因流較小，即種群間的遺傳變異較大。不同居群的遺傳分化有51.68%發(fā)生在種群之間，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果符合垂穗披堿草是自花授粉植物的特質(zhì)。Nei[20]認(rèn)為：自花授粉的植物種群間的基因流Nm<1。

3討論

不同放牧強(qiáng)度下垂穗披堿草種群的遺傳多樣性結(jié)果表明，在放牧條件下，中度放牧干擾下種群遺傳多樣性最高，其次是重度放牧，輕度放牧條件下種群的遺傳多樣性最低。物種遺傳多樣性的高低可以反映該物種或種群對環(huán)境的適應(yīng)能力以及本身的進(jìn)化

表5　處理組間的遺傳分化系數(shù)與基因流

潛力和該種群的穩(wěn)定性。物種的遺傳多樣性越高，其對環(huán)境變化的適應(yīng)性就越強(qiáng)[21]。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果較為相似[22-23]，蒙旭輝等[22]的研究表明在中度放牧條件下放牧群落的多樣性指數(shù)要顯著地高于其他放牧干擾群落，中度放牧強(qiáng)度最為適宜草地群落類型。殷國梅等[24]的研究表明在不同的放牧強(qiáng)度干擾下，適度放牧可以使群落保持較高的密度和蓋度，群落較為穩(wěn)定，既可保證草地有一定的載畜量，又可以保持草地群落的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明放牧干擾對種群的遺傳多樣性有著明顯的影響并且在中度放牧條件下有利于維持物種的進(jìn)化潛力和穩(wěn)定性。這一結(jié)果也符合“中度干擾理論”[24-25]。原因可能是由于在重度放牧條件下，家畜的反復(fù)啃食會(huì)嚴(yán)重影響垂穗披堿草植株的正常生長，植物本身不能進(jìn)行正常的開花，結(jié)果，導(dǎo)致植物個(gè)體間及種群內(nèi)的基因流動(dòng)較小。放牧強(qiáng)度的差異進(jìn)而導(dǎo)致群落中優(yōu)勢種群的地位發(fā)生逐漸的變化[26]。而在輕度放牧條件下，由于牲畜的選擇性采食可能會(huì)降低垂穗披堿草在群落中的地位，群落中不同物種的競爭壓力影響到垂穗披堿草本身的遺傳多樣性。輕牧條件下，家畜攜帶種子造成的基因流動(dòng)較小，導(dǎo)致輕度放牧的遺傳多樣性最低。對照組的遺傳多樣性最高這一結(jié)果可能與試驗(yàn)地本身的封育時(shí)間有關(guān)。適宜的放牧強(qiáng)度能夠維持較高的地上生物量。不同強(qiáng)度的放牧干擾對物種多樣性的影響不同，適度放牧可以增加群落的多樣性， 而長期的過度放牧或者完全不放牧都將導(dǎo)致群落多樣性降低[27]。

本研究的4個(gè)在不同放牧強(qiáng)度干擾條件下的垂穗披堿草種群的遺傳分化系數(shù)為51.68%，基因流Nm=0.2337，說明4個(gè)種群的遺傳變異主要發(fā)生在種群之間?；蛄鬏^小，說明4個(gè)種群間很少發(fā)生基因流動(dòng)，這一方面可能與垂穗披堿草本身是自花授粉有關(guān)。種群之間很難通過花粉傳播發(fā)生基因流動(dòng)。另一方面也說明放牧干擾可以明顯地影響到植物種群的遺傳變化，基因流是影響自然植物種群間遺傳變異的關(guān)鍵因素。種群間高的基因流可以降低物種的遺傳分化并保持其完整性。在植物種群中，基因流一般通過種子或花粉進(jìn)行傳播，適量基因流可以有效地促進(jìn)居群地方性適應(yīng)以及多樣化[28]。本實(shí)驗(yàn)中的基因流較低, 低水平的基因流可以促進(jìn)居群對環(huán)境的適應(yīng)性，進(jìn)而造成種群之間的遺傳分化。高水平的基因流可以防止居群的分化。

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