孫　妍，陳高瞻，占衛(wèi)紅，雷　航，王心倩，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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非結(jié)核分枝桿菌MmpL家族同源性分析及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

孫妍，陳高瞻，占衛(wèi)紅，雷航，王心倩，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

摘要：以非結(jié)核分枝桿菌中的胞分枝桿菌、鳥分枝桿菌和恥垢分枝桿菌三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株為研究對象，對其MmpL家族蛋白的同源序列進(jìn)行相似性分析和功能預(yù)測。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中分枝桿菌MmpL蛋白序列進(jìn)行多重序列比對；用TMHMM Server 2.0在線軟件對MmpL同源序列進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測；用Interproscan對MmpL3同源序列進(jìn)行保守序列和結(jié)構(gòu)域分析。同源分析結(jié)果顯示：與H37Rv MmpL家族比較，胞分枝桿菌中沒有發(fā)現(xiàn)MmpL2、MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；鳥分枝桿菌沒有發(fā)現(xiàn)MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；恥垢分枝桿菌沒有發(fā)現(xiàn)MmpL2、MmpL7、MmpL9、MmpL10、MmpL12和MmpL13的同源序列，推測可能與菌種差異性有關(guān)；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)大部分同源序列跨膜次數(shù)與H37Rv的對應(yīng)MmpL蛋白保持一致，少數(shù)序列與H37Rv的對應(yīng)MmpL蛋白有較小偏差；保守序列分析發(fā)現(xiàn)：與H37Rv比較三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL3同源序列有兩個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域(MMPL domain)，沒有固醇敏感多肽區(qū)(SSD domain)說明該同源序列有膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，無SSD介導(dǎo)的膽固醇自我平衡調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明非結(jié)核分枝桿菌的毒力、致病機(jī)制和疾病趨勢提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：非結(jié)核分枝桿菌；MmpL家族蛋白；同源序列；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

1引言

非結(jié)核分枝桿菌(NontuberculosisMycobacteria，NTM)是指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(M.tuberculosscomplex)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)以外的分枝桿菌。其中部分是致病菌或條件致病菌，臨床上能引起人類疾病的主要有堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌等10余種[1]。廣泛存在于環(huán)境中，能引起人類和動物肺部病變和肺部外其他部位患病[2]，做為條件致病菌可與結(jié)核分枝桿菌混合感染。臨床癥狀多與結(jié)核分枝桿菌相似，在臨床診斷上容易誤診，通過抗酸染色不能分辨[3]。且對多種抗結(jié)核藥物具有耐藥性。

MmpL家族是分枝桿菌耐受-結(jié)節(jié)-分裂家族(resistance-nodulation-cell division family,RND家族)超家族蛋白中特有的一類膜蛋白，是影響分枝桿菌的生存和毒力的關(guān)鍵因子之一[3]，主要參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和藥物外排[4-6]。RND家族中固醇敏感多肽區(qū)(SSD domain)在膽固醇自我平衡調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在基因組中，有大約20%—30%的基因產(chǎn)物被預(yù)測為膜蛋白，在藥物研發(fā)過程中，膜蛋白偶聯(lián)受體是絕大多數(shù)藥物的作用靶點(diǎn)，跨膜蛋白在生物體中擔(dān)負(fù)著各種各樣的重要功能：細(xì)胞的運(yùn)輸，細(xì)胞膜內(nèi)外信號的傳遞及能量轉(zhuǎn)換等[8]。由于膜蛋白數(shù)量巨大而且功能多樣，因此通過跨膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能對其功能進(jìn)行初步預(yù)測。

筆者以非結(jié)核分枝桿菌胞分枝桿菌、鳥分枝桿菌和恥垢分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為研究對象，對其MmpL家族蛋白進(jìn)行同源性分析、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測以及保守序列和結(jié)構(gòu)域預(yù)測，為進(jìn)一步闡明抗酸染色陽性非結(jié)核分枝桿菌的毒力、致病機(jī)制和疾病研究提供理論依據(jù)。

2方法和步驟

2.1方法

運(yùn)用生物信息學(xué)方法，通過序列對比，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，保守序列和結(jié)構(gòu)分析等生物信息學(xué)手段，對胞分枝桿菌(M.intracellulareATCC13950)、鳥分枝桿菌(M.aviumsubsp.paratuberculosisK-10)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatistrMC2155)的MmpL家族蛋白進(jìn)行同源序列分析及功能預(yù)測。

2.2步驟

2.2.1MmpL家族蛋白同源序列比對

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找結(jié)核分枝桿菌(MTB)H37Rv的MmpL家族蛋白的氨基酸序列，在BLAST搜索三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的同源序列。

2.2.2MmpL家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

用TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件對MmpL家族蛋白進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測。

2.2.3MmpL3保守序列分析

用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)對MmpL3進(jìn)行保守序列和結(jié)構(gòu)域分析。

3結(jié)果

3.1MmpL家族蛋白同源序列比對

同源分析結(jié)果顯示：與H37Rv的MmpL家族蛋白比較，胞分枝桿菌同源序列為MmpL1(Ident，63%)，MmpL3 (Ident， 68%)，MmpL4(Ident，62%、57%、54%)，MmpL5(Ident，73%)，MmpL10(Ident，61%)，MmpL11(Ident，72%)；鳥分枝桿菌同源序列為MmpL1(Ident，53%)，MmpL2(Ident，61%)，MmpL3(Ident，70%)，MmpL4(Ident，66%、62%、61%、60%、58%)，MmpL5(Ident，73%)，MmpL10(Ident，57%)，MmpL11(Ident，76%)；恥垢分枝桿菌同源序列為MmpL1(Ident，54%、46%)，MmpL3(Ident，67%)，MmpL4(Ident，66%、63%、56%、55%)，MmpL5(Ident，69%、64%)，MmpL6(Ident，51%)，MmpL8(Ident，56%、51%)，MmpL11(Ident，69%)。此外，同源比對還發(fā)現(xiàn)在胞分枝桿菌中沒有發(fā)現(xiàn)MmpL2、MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；鳥分枝桿菌沒有發(fā)現(xiàn)MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13的同源序列；恥垢分枝桿菌沒有發(fā)現(xiàn)MmpL2、MmpL7、MmpL9、MmpL10、MmpL12和MmpL13的同源序列。

3.2MmpL家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

用TMHMM 2.0軟件對MmpL家族蛋白及其同源序列跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測見表1，胞分枝桿菌，鳥分枝桿菌，恥垢分枝桿菌的MmpL3同源蛋白跨膜次數(shù)分別為10、10、11(圖1)。

圖1　MmpL3跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(A—D)

對三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株MmpL家族蛋白序列進(jìn)行同源比對和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)合同源性、蛋白注釋和跨膜次數(shù)篩選出MmpL家族成員見表1。

表1MmpL家族成員

成員H37RvM.intracellulareATCC13950M.aviumsubsp.paratuberculosisK-10M.smegmatistr.MC2155成員TMMs成員TMMs成員TMMs成員TMMsMmpL1Rv0402c12OCU0075011MAP007612MSMEG038112MSMEG018012MmpL2Rv050711NOMAP3049c12NOMmpL3Rv0206c11OCU4887010MAP3641c12MSMEG025011MmpL4Rv0450c11OCU4565011MAP375111MSMEG349611OCU3155011MAP389011MSMEG022511MSMEG046311MmpL5Rv0676c12OCU2492011MAP173812MSMEG438312MSMEG138212MmpL6Rv15575NONONOMmpL7Rv294212OCU5116012NONOMmpL8Rv3823c12NONOMSMEG474112MSMEG462512MmpL9Rv233911NONONOMmpL10Rv118311OCU1835011MAP22326NOMmpL11Rv0202c12OCU4892012MAP3637c12MSMEG024111MmpL12Rv1522c11NONONOMmpL13a)Rv11454NONONOb)Rv11466NONONOMmpLNNO748Total14151219

注：TMMs：跨膜次數(shù)；MmpL N：表中所列之外的MmpL家族蛋白成員。

3.3MmpL3同源序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測

H37Rv的MmpL3結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示具有兩個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MMPL domain)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)固醇敏感多肽區(qū)(Sterol-sensing domain, SSD)，三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL3同源蛋白均有兩個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域，沒有SSD結(jié)構(gòu)域，說明該同源序列有膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，無SSD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的膽固醇自我平衡調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能(圖2)。

圖2　MmpL3跨膜結(jié)構(gòu)(A-D)

4討論

MmpL家族蛋白是一組與結(jié)核分枝桿菌藥物外排有關(guān)的一個(gè)跨膜蛋白家族，可作為抗結(jié)核藥物或菌種鑒定藥物提供靶位點(diǎn)。通過對三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的生物信息學(xué)分析得到MmpL家族同源序列，其中胞分枝桿菌為15個(gè)，鳥分枝桿菌為12個(gè)，恥垢分枝桿菌為19個(gè)。經(jīng)過同源分析和跨膜預(yù)測綜合分析最終胞分枝桿菌確定7個(gè)同源序列，鳥分枝桿菌確定10個(gè)同源序列，恥垢分枝桿菌確定11個(gè)同源序列。與2005年研究結(jié)果[8]相比得到更為精確的結(jié)果，該文獻(xiàn)只對鳥分枝桿菌中的8個(gè)同源蛋白進(jìn)行了同源分析，這8個(gè)序列中有5個(gè)序列與本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果相同，3個(gè)序列分析結(jié)果不同，有10個(gè)成員分析不夠精確。在分析MmpL家族成員的同源蛋白的過程中增加跨膜結(jié)構(gòu)作為分析條件未見報(bào)道。

除此之外在對實(shí)驗(yàn)所得同源序列進(jìn)行比較分析的過程中發(fā)現(xiàn)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株中大多數(shù)MmpL蛋白存在同源序列，但是胞分枝桿菌沒有MmpL2、MmpL6、MmpL8、MmpL9蛋白的同源序列；鳥分枝桿菌沒有MmpL6、MmpL7、MmpL8、MmpL9、MmpL12和MmpL13同源序列；恥垢分枝桿菌沒有MmpL2、MmpL6、MmpL7、MmpL10、MmpL12和MmpL13同源序列；這種現(xiàn)象可能與菌種差異性有關(guān)，可能為以后菌種鑒定提供理論支持。

對MmpL3進(jìn)行保守序列和結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)MmpL3的同源序列有膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋但可能不具有SSD結(jié)構(gòu)域在膽固醇自我平衡調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，這可能與菌種遺傳差異有關(guān)，可能為后續(xù)菌種鑒定提供依據(jù)。

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Homology analysis and function prediction of MmpL

protein family ofNontuberculousMycobacterion

SUNYan,CHENGao-zhan,ZHANWei-hong,LEIHang,WANGXin-qian,YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：To provide evidence for future research on the structures and function of MmpL protein family in Mycobacterium ,this study analyzed homologous sequences, predicted topological structures and predicted conservative domain structures of three Nontuberculous Mycobacterion named M. intracellulare, M. avium subsp.paratuberculosis K-10 and M. smegmatisstr. According to the homologous sequences three of NTM all have theregion of deletions. For example the M. intracellulare haven’t MmpL2, 6, 7, 8, 9, 12, 13，M. avium subsp.paratuberculosis K-10haven,t MmpL6, 7, 8, 9, 12, 13，M. smegmatisstrhaven,t MmpL2, 7, 9, 10, 12, 13. According to the topological structures many of the homologous sequences have the same transmembrane and few of them have different transmembrane, but all of them have little difference. Conservative sequence analysis found that: compared with H37Rv three standard strains of MmpL3 homologous sequences, there were two membrane transport protein structure domain (MMPL domain), no sterol-sensing domain(SSD domain) showd the membrane function, the homologous sequence of no self balance function of intracellular cholesterol levels.The research results further clarify the virulence of M. tuberculosis, pathogenic mechanism and trend of disease to provide basic data.

Key words：Nontuberculous Mycobacterion；MmpL protein family；homologous sequence；topological structure

中圖分類號：Q 93

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A