韓悅河南師范大學生命科學學院

單細胞測序技術(shù)的研究與應(yīng)用進展

韓悅
河南師范大學生命科學學院

傳統(tǒng)的測序方法是對細胞群體的總平均反應(yīng)進行分析，而細胞間存在異質(zhì)性。單細胞測序是在單個細胞水平上進行的高通量測序技術(shù)，可準確測出單個細胞的基因結(jié)構(gòu)及表達狀態(tài)，分析同一表型細胞間的遺傳異質(zhì)性，在癌癥、微生物學等領(lǐng)域有舉足輕重的地位。本文對單細胞測序主要流程及該技術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用進展進行闡述，為這一技術(shù)的研究與發(fā)展提供參考。

單細胞分離；基因組擴增；應(yīng)用

隨著科技水平的發(fā)展，DNA測序技術(shù)經(jīng)歷了巨大的革命。從20世紀70年代中期以Sanger為代表發(fā)明的第一代測序技術(shù)--雙脫氧鏈終止法，到2005年后涌現(xiàn)出以454、Solexa、SOLiD為第二代標志的高通量測序技術(shù)，再到第三代的單分子測序技術(shù)，DNA測序技術(shù)在成本、讀長和通量三方面都發(fā)生很大的變化。其中應(yīng)用最廣泛的當屬高通量測序技術(shù)，但這種測序手段也存在一些問題：傳統(tǒng)的測序方法是對細胞群體的總平均反應(yīng)進行分析，而細胞間存在異質(zhì)性，由此單細胞測序技術(shù)應(yīng)運而生。

單細胞測序是在單個細胞水平上進行的高通量測序技術(shù)，可準確測出單個細胞的基因結(jié)構(gòu)及表達狀態(tài)，分析同一表型細胞間的遺傳異質(zhì)性，在癌癥、微生物學等領(lǐng)域有舉足輕重的地位[1]。單細胞檢測技術(shù)操作步驟主要包括四步：單個細胞的分離、細胞溶解與基因組的提取、基因組或轉(zhuǎn)錄組擴增，基因組測序。其中單細胞的分離與基因組或轉(zhuǎn)錄組的擴增技術(shù)還有待提高，這對單細胞測序的發(fā)展既是機遇也是挑戰(zhàn)。本文對單細胞測序主要流程及該技術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用進展進行闡述，為這一技術(shù)的研究與發(fā)展提供參考。

1.單細胞的分離

獲取分離的單個細胞是進行單細胞測序研究的第一步，也是單細胞測序與傳統(tǒng)高通量測序技術(shù)的最大區(qū)別。目前可采用的分離方法有有限稀釋法、顯微操作法、熒光激活細胞分選法（FACS）、和微流控技術(shù)等。

有限稀釋法是將獲取的細胞系按比例稀釋配制成不同濃度的細胞懸液，然后將其接種于多孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)，以獲得單個細胞。該方法操作簡便，成本低，適用于研究可培養(yǎng)的樣本；但操作費時，不能進行大規(guī)模的細胞分離，分離過程常出現(xiàn)細胞丟失或分離錯誤等現(xiàn)象。顯微操作法需要在倒置顯微鏡下借助機械顯微操作儀進行精細操作，優(yōu)點在于成本低廉，分離過程可視化且容易操作；缺點在于細胞機械性損傷，適于低通量的細胞操作。

熒光激活細胞分選法是當前應(yīng)用最廣泛的細胞分離方法。該方法通量高，靈敏度高，但需制備大量樣品。隨著技術(shù)的發(fā)展，又興起了一種名為微流控裝置的新技術(shù)。是通過人工調(diào)控流體流動將樣品流經(jīng)微通道，該通道直徑可在數(shù)十到數(shù)百微米范圍調(diào)節(jié)，當設(shè)置大小僅可通過一個細胞[2]，以這種方式達到細胞分離的目的。優(yōu)點在于該方法通量高，操作靈活，樣品需求量小，極大程度上避免了樣品的污染；但價格昂貴。

2.單細胞基因組或轉(zhuǎn)錄組的擴增

高通量測序所需樣品量至少為數(shù)十納克，而單細胞中僅含有數(shù)匹克的DNA或mRNA，因此對基因組或轉(zhuǎn)錄組進行了擴增是必要的。

2.1細胞溶解與基因組的獲取

獲得的單個細胞需要將其細胞膜溶解以獲取基因組DNA （gDNA)或mRNA。一般常采用的細胞溶解方法包括物理法、化學法和酶解法，方法的選擇要根據(jù)細胞特性、gDNA或mRNA純化的難易程度等方面綜合考慮，有時需使用多種方法結(jié)合以達到理想效果。為了防止gDNA在純化時發(fā)生基因丟失現(xiàn)象，故常忽略此操作，因此要對細胞溶解這一步驟進行嚴格操作。此外，還要避免采用的溶解試劑與gDNA或mRNA擴增試劑相互作用而影響擴增效果。

2.2單細胞基因組的擴增

2.2.1單細胞全基因組擴增

全基因組擴增（WGA）是將從單細胞中提取出的DNA進行擴增以獲取大量DNA樣品的技術(shù)。Roger Lasken團隊通過研發(fā)多重置換擴增技術(shù)，成為世界上首個成功對單細胞DNA擴增及測序的團隊。這項技術(shù)利用Phi29等聚合酶可以將通過變性、退火、結(jié)合到模板DNA上的任意隨機引物進行不斷延伸。在聚合酶的作用下，將在其附近的延伸鏈置換下來，且每一種聚合酶都能完成鄰近延伸鏈的置換，從而獲得可覆蓋全基因組的大量小片段及大片段產(chǎn)物用來進行基因測序。

為克服基因組的擴增偏倚現(xiàn)象，謝曉亮教授等在2012年研發(fā)一種新技術(shù)--多重退火環(huán)狀擴增循環(huán)技術(shù)[3]，該技術(shù)將MDA與PCR的優(yōu)點相結(jié)合，同時利用環(huán)狀DNA分子不能擴增這一原理，將基因組先采用MDA進行5輪預(yù)擴增，新擴增出的大量產(chǎn)物可閉合的形成環(huán)狀分子，使擴增過程變?yōu)榫€性擴增。然后進行PCR擴增，最終獲得擴增較均一的單細胞全基因組。

2.2.2單細胞轉(zhuǎn)錄組的擴增

轉(zhuǎn)錄組的擴增需要將單細胞內(nèi)的mRNA提取后，通過反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對cDNA進行擴增。一般常采用PCR指數(shù)擴增、體外轉(zhuǎn)錄線性擴增和Phi29聚合酶擴增三種方法。PCR擴增法是通過在cDNA兩端加上錨定引物后進行PCR擴增[4]。反轉(zhuǎn)錄過程中通常在轉(zhuǎn)錄本（成熟mRNA）的3’端引入引物oligo(dT)，5’端可采用STRT-seq和Smart-seq方法引入錨定引物。體外轉(zhuǎn)錄擴增法中，反轉(zhuǎn)錄是用T7 RNA聚合酶啟動子序列和oligo(dT)分別作為5’和3’端的引物合成第一鏈cDNA,并隨后合成第二鏈，然后T7 RNA聚合酶以第二鏈cDNA為的模板在體外進行轉(zhuǎn)錄。

3.單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用

3.1腫瘤研究

3.1.1乳腺癌的演變

通過制備兩個腫瘤樣品，一種是有不同類型的腫瘤細胞組成的多基因組型，另一種是單一遺傳型細胞組成的單基因組型，然后利用流式分選儀分離出一百個上述的兩種細胞類型并進行全基因組測序。研究結(jié)果表明，第一種多基因組型腫瘤細胞有三種克隆表達，而第二種單基因組腫瘤細胞是由單個腫瘤細胞以單克隆形式組成，這揭示腫瘤細胞的演變是間斷性而非逐步發(fā)生的。這一研究結(jié)果為癌癥的研究與臨床治療提供了重要依據(jù)。

3.1.2基因診斷與癌癥無創(chuàng)治療[5]

通過對單個腫瘤細胞的全基因組進行測序，并與人類正?；驁D譜進行比對，可找出引起癌癥的突變基因。利用這種方法進行基因檢測，可以檢查出潛在的癌基因，了解腫瘤的起源和生長規(guī)律，以便進行及時預(yù)防、治療。

大多數(shù)癌癥患者由于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移而治療無效死亡，這一過程往往是腫瘤細胞通過外周血循環(huán)來實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。對外周血循環(huán)腫瘤細胞進行全基因組測序與外顯子測序，可以了解腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程的機制，使癌癥的無創(chuàng)治療成為可能，同時對癌癥的治療、預(yù)后以及復發(fā)均有很好的指導作用。

3.2微生物研究

單細胞測序技術(shù)為研究自然界難以培養(yǎng)的微生物提供可能。通過對單個微生物進行全基因組測序，可以逐步構(gòu)建更加完備的微生物基因庫，利于對存在于海洋等蘊含豐富資源的環(huán)境中微生物種類及功能的檢定，促進科學家對微生物進化、生長等生命活動的研究。

4.前景展望

單細胞測序技術(shù)對研究細胞異質(zhì)性問題上提供了極大的幫助，在腫瘤的研究與臨床治療、微生物學研究等領(lǐng)域已取得一定成果。但在技術(shù)操作上還存在一些問題，如單細胞分離對細胞的損傷，細胞溶解過程中遺傳物質(zhì)的丟失，擴增過程中出現(xiàn)的基因偏倚性等問題。因此，技術(shù)方法的革新可推動單細胞測序的發(fā)展與應(yīng)用。此外，應(yīng)注意單細胞基因的表達受所處環(huán)境的影響，對單細胞轉(zhuǎn)錄組進行測序時，應(yīng)注意單細胞的情況不一定能揭示細胞群體的基因表達規(guī)律。此外，單細胞基因的表達受所處環(huán)境的影響，對單細胞轉(zhuǎn)錄組進行測序時，應(yīng)注意單細胞的情況不一定能揭示細胞群體的基因表達規(guī)律。

總的來說，單細胞測序技術(shù)具有廣闊的前景，尤其是在探究癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制、耐藥性機制以及預(yù)后檢測等方面。相信隨著單細胞分離及基因組擴增技術(shù)的發(fā)展，對腫瘤細胞的生長規(guī)律、耐藥機制研究的不斷深入，癌癥無創(chuàng)治療將會成為現(xiàn)實。

[1]朱忠旭，陳新.單細胞測序技術(shù)及應(yīng)用進展[J].基因組學與應(yīng)用生物學，2015,34（5）：902-908.

[2]Yin H,Marshall D.Microfluidics for single cell analysis[J].Cur?rent Opinion in Biotechnology,2012,23(1):110-119.

[3]Zong C,Lu S.and Xie X.S.,2012,Genome-wide detection of sin?gle-nucleotide and copy-number variations of a single human cell,Sci?ence 338(6114):1622-1626.

[4]文路，湯富酬.單細胞測序分析研究進展[J].生命科學，2014,26(3）：228-233.

[5]Ni X，et al.Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(52):21083-21088.

韓悅（1995-），女，漢族，河南新鄉(xiāng)人，河南師范大學生命科學學院2013級生物技術(shù)專業(yè)在讀本科生。