王飛雨，　王新敏，　王　嬋，　王小芳，　張宇晴，　吳江東，　吳　芳，　張萬(wàn)江，　章　樂(lè)△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室， 2病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室， 3第一附屬醫(yī)院泌尿外科，4新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

?

靶向沉默Mcl-1基因?qū)Ω腥静煌玖Y(jié)核桿菌小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的影響*

王飛雨1,4，王新敏3，王嬋2,4，王小芳1,4，張宇晴1,4，吳江東1,4，吳芳1,4，張萬(wàn)江1,4，章樂(lè)1,4△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，3第一附屬醫(yī)院泌尿外科，4新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

[摘要]目的： 通過(guò)RNA干擾技術(shù)特異性沉默Mcl-1基因，探討下調(diào)Mcl-1基因?qū)Ω腥静煌玖Y(jié)核桿菌小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的影響。方法: 分別用制備好的新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)強(qiáng)毒結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(簡(jiǎn)稱強(qiáng)毒株)、結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株p7Rv(簡(jiǎn)稱p7Rv)、結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)無(wú)毒株p7Ra(簡(jiǎn)稱p7Ra)和卡介苗(BCG)菌懸液感染BALB/c小鼠，再以篩選并構(gòu)建好的Mcl-1-shRNA作用于感染的小鼠模型，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)對(duì)照組，于作用后1 d、3 d、5 d和7 d提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果: 小鼠被不同毒力的結(jié)核桿菌感染后其腹腔巨噬細(xì)胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有不同程度的升高，其中以感染了強(qiáng)毒株和p7Rv的腹腔巨噬細(xì)胞升高最為明顯(P<0.05)；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默Mcl-1基因后，Mcl-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，下調(diào)Mcl-1基因的表達(dá)可誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡。結(jié)論: 應(yīng)用Mcl-1-shRNA可有效沉默Mcl-1在感染了不同毒力結(jié)核桿菌小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，并能上調(diào)巨噬細(xì)胞的凋亡水平。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌； Mcl-1基因； 腹腔巨噬細(xì)胞； RNA干擾； 細(xì)胞凋亡

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是典型的胞內(nèi)致病菌，其能通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫細(xì)胞的殺傷及清除，從而影響其宿主細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞)的調(diào)控，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞不能正常凋亡[1]。髓樣細(xì)胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)基因隸屬于Bcl-2家族，其主要作用是抑制細(xì)胞凋亡，目前大量的研究表明，與Bcl-2家族其它成員相比，在表達(dá)Mcl-1基因的細(xì)胞中，其表達(dá)水平可能是決定細(xì)胞生存的關(guān)鍵因素[2]。因此本研究以Mcl-1基因作為支點(diǎn)，通過(guò)靶向沉默其表達(dá)，借以探討不同毒力結(jié)核桿菌感染小鼠后Mcl-1基因在宿主巨噬細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用和機(jī)制。

材料和方法

1菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株p7Rv、結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)無(wú)毒株p7Ra和卡介苗菌株(Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG)由中國(guó)藥物生物制品檢定所提供；新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)強(qiáng)毒結(jié)核分枝桿菌臨床分離株由本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定并保存。實(shí)驗(yàn)小鼠為8周齡SPF級(jí)(無(wú)特定病原體動(dòng)物)雌性BALB/c小鼠，重(18±2) g，共192只，購(gòu)于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2主要試劑

Super RT cDNA Kit及TRIzol Reagent 購(gòu)自Invitrogen；QuantiFast SYBR Green PCR Kit 購(gòu)自Qiagen；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒購(gòu)自TIANGEN；流式凋亡試劑盒(Annexin V-APC/7-AAD)購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；小鼠Mcl-1蛋白ELISA試劑盒購(gòu)自Cloud-Clone；兔多克隆抗體Mcl-1購(gòu)自Santa Cruz；β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體及山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore。

3方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為強(qiáng)毒株組、p7Rv組、p7Ra組、BCG組、強(qiáng)毒株+Mcl-1-shRNA組、p7Rv+Mcl-1-shRNA組、p7Ra+Mcl-1-shRNA組、BCG+Mcl-1-shRNA組、Mcl-1-shRNA組和空白對(duì)照組，在模型建立后的第1、3、5、7天設(shè)置4個(gè)時(shí)點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)各設(shè)3只小鼠。

3.2小鼠感染模型的建立在生物安全柜內(nèi)，以滅菌接種環(huán)取改良羅氏固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2～3周、狀態(tài)良好的結(jié)核桿菌菌落，置滅菌磨菌器中，加少量0.05% Tween-20 的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。利用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)細(xì)菌濃度約1.0×1010/L。將不同菌懸液經(jīng)小鼠腹腔分別注射到對(duì)應(yīng)分組的每只小鼠體內(nèi)，注射量約為0.3 mL[3]。將感染小鼠置生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，IVC籠具中飼養(yǎng)。

3.3小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集在上述不同時(shí)點(diǎn)將小鼠脫頸處死，用75%乙醇消毒小鼠腹部皮膚，置于超凈臺(tái)中；用鑷子將小鼠下腹部皮膚提起，剪開(kāi)一個(gè)小口，將皮膚撕開(kāi)，完全暴露腹膜；用鑷子提起腹膜，用5 mL注射器向小鼠腹腔中注入5 mL 1640培養(yǎng)基，反復(fù)按摩腹部10 min，避開(kāi)腸和脂肪，反復(fù)回抽腹腔液，不同的方向沖洗數(shù)次，最后吸出腹腔液；將細(xì)胞懸液1 200 r/min條件下離心5 min，棄上清，PBS液洗滌l次，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸起；將細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,貼壁細(xì)胞即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞[4]。

3.4ELISA法篩選Mcl-1-shRNA最佳劑量及最佳處理時(shí)間按照質(zhì)粒大量抽提試劑盒操作說(shuō)明提取已篩選并構(gòu)建好的Mcl-1-shRNA質(zhì)粒[5]，隨機(jī)選取48只正常BALB/c小鼠，分為每只0 μg、50 μg、75 μg和100 μg 4個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)置1 d、3 d、5 d和7 d 4個(gè)時(shí)點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)3只小鼠，將質(zhì)粒DNA采用hydrodynamic技術(shù)注入各組小鼠體內(nèi)[6]，在上述不同時(shí)點(diǎn)，分別提取培養(yǎng)各組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液抽提小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總蛋白，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，計(jì)算各組中Mcl-1蛋白含量。隨機(jī)選取24只BALB/c小鼠，在生物安全柜內(nèi)經(jīng)腹腔接種BCG菌懸液0.3 mL，于感染后的1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d分別提取培養(yǎng)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液抽提小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總蛋白，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，計(jì)算Mcl-1的蛋白含量。

3.5應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Mcl-1的mRNA表達(dá)用TRIzol法分別提取各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定并計(jì)算提取的總RNA含量及濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將各組細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Mcl-1的mRNA表達(dá)。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1　引物序列

3.6應(yīng)用Western blot檢測(cè)Mcl-1的蛋白表達(dá)用蛋白裂解液裂解小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后分別提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定及配平，10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，半干電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(23 V，40 min)，室溫封閉2 h，與1∶1 000 兔抗鼠Mcl-1多抗反應(yīng)后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng) II 抗孵育1 h，ECL法顯色壓片曝光，用凝膠成像儀分析系統(tǒng)對(duì)Western blot檢測(cè)條帶進(jìn)行灰度值掃描，計(jì)算Mcl-1與β-actin吸光度比值，進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3.7應(yīng)用Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡提取各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，根據(jù)凋亡試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，將收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌2次，用預(yù)冷的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×109/L，每管加入100 μL細(xì)胞，5 μL的Annexin V-APC和10 μL的7-AAD，混合后避光于冰上靜止30 min，最后每管加入400 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer，30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)資料進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1Mcl-1-shRNA最佳劑量及最佳處理時(shí)間的篩選

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在3種質(zhì)粒濃度作用下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Mcl-1蛋白的表達(dá)均有不同程度的下調(diào)(P<0.05)，其中每只75 μg和100 μg作用最為明顯，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故以每只75 μg作為Mcl-1-shRNA作用的最佳劑量。小鼠予BCG菌懸液感染造模，在感染后第1天的Mcl-1蛋白已有表達(dá)，并呈上升趨勢(shì)，于第3天達(dá)高峰，隨后表達(dá)逐漸降低，故選擇Mcl-1蛋白表達(dá)水平最高的第3天為質(zhì)粒開(kāi)始作用的最佳時(shí)點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The protein levels of Mcl-1 in the mouse peritoneal macrophages treated with Mcl-1-shRNA at different concentrations (A) and infected with BCG (B) determined by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg;#P<0.05vs50 μg;△P<0.05vs75 μg;▽P<0.05vs100 μg.

圖1ELISA法檢測(cè)各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Mcl-1蛋白的表達(dá)

2Mcl-1 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

應(yīng)用2-ΔΔCt法分析后結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，不同毒力結(jié)核桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Mcl-1 mRNA的表達(dá)水平均有不同程度的增高，其中以強(qiáng)毒株組和p7Rv組增高最為明顯(P<0.05)，p7Ra組和BCG組雖Mcl-1的mRNA水平有所上升，但與對(duì)照組相比差異不顯著，而Mcl-1的mRNA表達(dá)水平并未因作用時(shí)間的不同而表現(xiàn)出明顯差異。應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組與未用質(zhì)粒干預(yù)的對(duì)照組相比，Mcl-1-shRNA質(zhì)粒干預(yù)后各組Mcl-1的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，其中未感染組下調(diào)約80%，最為明顯(P<0.05)，感染了p7Ra和BCG的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別下調(diào)約74%和75%(P<0.05)，感染了強(qiáng)毒株和p7Rv的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞下調(diào)趨勢(shì)稍弱，分別下調(diào)約65%和70%(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Real time-PCR was used to determine the mRNA expression of Mcl-1 in the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisand treated with or without Mcl-1-shRNA. A: control group; B: BCG group; C: p7Ra group; D: p7Rv group; E: virulence strains of Xinjiang group; F: Mcl-1-shRNA group; G: Mcl-1-shRNA+BCG group; H: Mcl-1-shRNA+p7Ra group; I: Mcl-1-shRNA+p7Rv group; J: Mcl-1-shRNA+virulence strains of Xinjiang group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBCG group;△P<0.05vsp7Ra group;▽P<0.05vsp7Rv group;☆P<0.05vsvirulence strains of Xinjiang group.

圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Mcl-1的mRNA表達(dá)

3Mcl-1蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，不同毒力結(jié)核桿菌感染后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的Mcl-1蛋白表達(dá)水平均有不同程度的增高，其中以強(qiáng)毒株組和p7Rv組增高最為明顯(P<0.05),分別為對(duì)照組的4.32倍和3.63倍，p7Ra組和BCG組的Mcl-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異不顯著，且Mcl-1蛋白的表達(dá)水平未因作用時(shí)間的不同而表現(xiàn)出明顯差異(P>0.05)。應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組與未用質(zhì)粒干預(yù)的對(duì)照組相比，Mcl-1-shRNA質(zhì)粒干預(yù)后各組Mcl-1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，其中未感染組下調(diào)約67%(P<0.05)，感染了BCG組、p7Ra組、p7Rv組和強(qiáng)毒株組分別下調(diào)約77%、79%、57%和63%(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，感染了強(qiáng)毒株組、p7Rv組、p7Ra組和BCG組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡率均有不同程度的升高(P<0.05)，且以建模后第5天凋亡率最高(P<0.05)，其中p7Ra組和BCG組的凋亡率上升最為明顯，強(qiáng)毒株組和p7Rv組的上升程度稍弱。應(yīng)用Mcl-1-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組與未用質(zhì)粒干預(yù)的對(duì)照組相比，Mcl-1-shRNA質(zhì)粒干預(yù)后各組細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)，其中以p7Ra組和BCG組上調(diào)程度最為明顯，強(qiáng)毒株組、p7Rv組次之，未感染組上調(diào)趨勢(shì)稍弱，見(jiàn)圖4、表2。

討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種保守死亡方式，其在維持組織動(dòng)態(tài)平衡、機(jī)體正常發(fā)育、排除受損或病毒感染的細(xì)胞中有著不可或缺的作用。早前研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，主要寄居存活在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)，若宿主巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，便可殺死寄生于其內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，阻止其在體內(nèi)繁衍播散，同時(shí)亦可將鄰近未感染的巨噬細(xì)胞激活，增強(qiáng)機(jī)體清除殺傷結(jié)核分枝桿菌的能力[7]。因此，宿主巨噬細(xì)胞的凋亡影響著結(jié)核分枝桿菌的命運(yùn)。近年研究表明宿主巨噬細(xì)胞凋亡水平因其感染結(jié)核分枝桿菌毒力的不同而存在差異[8]，有毒的結(jié)核桿菌可通過(guò)多種機(jī)制阻止宿主細(xì)胞的凋亡，其中被廣泛研究的是增加可溶性TNF受體的活化、減少FasL的激活、誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的表達(dá)來(lái)抑制宿主細(xì)胞的凋亡。

Figure 3.The protein expression of Mcl-1 in the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisand treated with or without Mcl-1-shRNA determined by Western blot. A: control group; B: BCG group; C: p7Ra group; D: p7Rv group; E: virulence strains of Xinjiang group; F: Mcl-1-shRNA group; G: Mcl-1-shRNA+BCG group; H: Mcl-1-shRNA+p7Ra group; I: Mcl-1-shRNA+p7Rv group; J: Mcl-1-shRNA+virulence strains of Xinjiang group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBCG group;△P<0.05vsp7Ra group;▽P<0.05vsp7Rv group;☆P<0.05vsvirulence strains of Xinjiang group.

圖3Western blot檢測(cè)Mcl-1蛋白的表達(dá)

Bcl-2家族在凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[9]，其由抗凋亡和促凋亡兩類基因組成。Mcl-1是Bcl-2家族中的抗凋亡基因，與Bcl-2有著類似的結(jié)構(gòu)和功能,其作用主要是維持細(xì)胞線粒體膜的穩(wěn)定、抑制細(xì)胞色素C的釋放、促進(jìn)細(xì)胞的生存、抑制細(xì)胞的凋亡[10]。Mcl-1在多種細(xì)胞系的凋亡、分化和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[11]，由于它的半衰期短，可快速對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境因素的改變做出反應(yīng),因此被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最為重要的抗凋亡因子[12]。Sly等[13]早期發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞和來(lái)源于人單核細(xì)胞系的巨噬細(xì)胞在吞噬結(jié)核分枝桿菌毒力株p7Rv后，其Mcl-1的mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)，并抑制了巨噬細(xì)胞的凋亡，用Mcl-1的mRNA反義寡脫氧核糖核酸處理后，被p7Rv感染的巨噬細(xì)胞的凋亡水平明顯升高。隨后有研究者用不同的細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是長(zhǎng)期的還是短暫的感染，巨噬細(xì)胞內(nèi)Mcl-1的mRNA表達(dá)水平在感染前后均存在差異，并且這種表達(dá)的差異影響了巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的清除[14]。

Figure 4.The apoptotic rates of the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisand treated with or without Mcl-1-shRNA analyzed by flow cytometry with Annexin V-APC/7-AAD staining.

圖4細(xì)胞凋亡檢測(cè)流式圖

表2　各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡率

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBCG group;△P<0.05vsp7Ra group;▽P<0.05vsp7Rv group;☆P<0.05vsvirulence strains of Xinjiang group;▲P<0.05vs1 d;▼P<0.05vs3 d;★P<0.05vs5 d;＄P<0.05vs7 d.

目前對(duì)Mcl-1基因的研究主 要集中在腫瘤相關(guān)疾病中，Mcl-1高表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞系中， 并能阻礙腫瘤細(xì)胞凋亡， 對(duì)抗化療藥物的殺傷作用， 有研究者采用靶向沉默Mcl-1基因的方式， 通過(guò)RNA干擾技術(shù)下調(diào)腫瘤細(xì)胞中Mcl-1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡率被顯著上調(diào)， 并且正常細(xì)胞未受到明顯影響[15]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們以動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為主，探討不同毒力的結(jié)核桿菌感染在體內(nèi)能否誘導(dǎo)Mcl-1基因的表達(dá)，并驗(yàn)證RNA干擾技術(shù)能否下調(diào)感染巨噬細(xì)胞內(nèi)Mcl-1基因的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠感染的結(jié)核桿菌毒力越強(qiáng)所誘導(dǎo)的Mcl-1mRNA和蛋白的表達(dá)水平越高，感染p7Ra和BCG菌株后雖可誘導(dǎo)Mcl-1的表達(dá)，但與空白對(duì)照組相比并無(wú)顯著差異，Mcl-1-shRNA質(zhì)粒作用后明顯下調(diào)了各組細(xì)胞內(nèi)Mcl-1的表達(dá)，其中感染p7Ra和BCG組下調(diào)趨勢(shì)明顯高于強(qiáng)毒株和p7Rv組，由此我們推測(cè)Mcl-1主要被毒力強(qiáng)的結(jié)核桿菌所誘導(dǎo)，Mcl-1-shRNA可有效抑制Mcl-1基因的表達(dá)。此外，為了更詳盡地探討Mcl-1對(duì)感染不同毒力結(jié)核桿菌小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的影響，本研究檢測(cè)了各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌毒力越強(qiáng)宿主巨噬細(xì)胞的凋亡率越低，這與早前的研究結(jié)果一致，Mcl-1-shRNA質(zhì)粒作用后明顯上調(diào)了各組細(xì)胞的凋亡水平，且感染了p7Ra和BCG組比感染了強(qiáng)毒株和p7Rv組更能顯著地誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡，并于第5天凋亡率最高，而Mcl-1的表達(dá)水平并未因作用時(shí)間的不同而出現(xiàn)差異，由此我們推測(cè)Mcl-1被毒力菌誘導(dǎo)可能是其一種抗凋亡機(jī)制；下調(diào)Mcl-1基因的表達(dá)可增強(qiáng)宿主巨噬細(xì)胞的凋亡水平； Mcl-1亦可能通過(guò)直接或間接影響其它抗凋亡途徑來(lái)調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡水平； Mcl-1的抗凋亡作用可能是結(jié)核桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生存以及衍生擴(kuò)散的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)寄居于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核桿菌可通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡基因Mcl-1的表達(dá)來(lái)遏止宿主細(xì)胞的凋亡，并且Mcl-1的表達(dá)水平與結(jié)核桿菌毒力的強(qiáng)弱有關(guān)。Mcl-1-shRNA可明顯沉默受結(jié)核桿菌感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)Mcl-1的表達(dá)，并上調(diào)宿主細(xì)胞的凋亡水平，由此闡明Mcl-1基因表達(dá)的高低影響著結(jié)核桿菌宿主細(xì)胞的凋亡，且有毒的結(jié)核桿菌所高表達(dá)的Mcl-1可能為其逃避宿主細(xì)胞的殺傷提供一個(gè)額外的保護(hù)。本研究為今后防治結(jié)核病提供了一個(gè)新方向，然而Mcl-1-shRNA作用在體內(nèi)有無(wú)其它影響還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，且結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展由諸多因素影響，毒力株通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)Mcl-1的表達(dá)還需深入研究。

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*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81202949; No. 81370381)；山東省自然科學(xué)基金聯(lián)合專項(xiàng)(No. ZR2014HL013)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2013WSB31009)

▲并列第1作者

Effects ofMcl-1 silencing on apoptosis of mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisWANG Fei-yu1,4, WANG Xin-min3, WANG Chan2,4, WANG Xiao-fang1,4, ZHANG Yu-qing1,4, WU Jiang-dong1,4, WU Fang1,4, ZHANG Wan-jiang1,4, ZHANG Le1,4

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofPathogenBiologyandImmunology,3DepartmentofUrinarySurgery,FirstAffiliatedHospital,4KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseasesCooperatedbyEducationMinistrywithXinjiangProvince,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China.E-mail: 1257067540@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of inhibiting Mcl-1 gene expression on apoptosis of mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of Mycobacterium tuberculosis using a technique of RNA interference. METHODS: The BALB/c mice were infected with prepared bacterium of the virulence strains of Xinjiang, p7Rv, p7Ra and BCG. Mcl-1-shRNA was applied to the mouse model of infection, and the control groups were set up. On 1 d, 3 d, 5 d and 7 d, the mouse peritoneal macrophages were collected. The expression of Mcl-1 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. The apoptotic rate of peritoneal macrophages was analyzed by flow cytometry. RESULTS: The expression of Mcl-1 at mRNA and protein levels was up-regulated in the peritoneal macrophages from the mice infected with different virulence of Mycobacterium tuberculosis, and the cells from the mice infected with virulence strains of Xinjiang and p7Rv expressed higher level of Mcl-1 than the uninfected control cells (P<0.05). The expression of Mcl-1 at mRNA and protein levels was reduced by RNA interference as compared with control group (P<0.05). Inhibition of Mcl-1 expression induced apoptosis of peritoneal macrophages in the mice. CONCLUSION: The Mcl-1 expression at mRNA and protein levels in mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of Mycobacterium tuberculosis was effectively suppressed by Mcl-1-shRNA, which can induce macrophage apoptosis.

[KEY WORDS]Mycobacterium tuberculosis; Mcl-1 gene; Peritoneal macrophages; RNA interference; Apoptosis

通訊作者△秦樹存 Tel： 0538-6237252; E-mail: shucunqin@hotmail.com； 姚樹桐 Tel： 0538-6225010; E-mail: yst228@126.com

[收稿日期]2015- 07- 03[修回日期] 2015- 07- 22

[文章編號(hào)](責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)1000- 4718(2015)12- 2202- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.014

[中圖分類號(hào)]R363.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A