王晉竹　葛　鳳　婁　寧　胡曉琳　董振華　王文匯

(山東大學齊魯醫(yī)院(青島)內分泌科,山東　青島　266011)

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胰高血糖素樣肽-1對肥胖2型糖尿病大鼠胰島素敏感性的改善作用

王晉竹葛鳳婁寧1胡曉琳1董振華1王文匯

(山東大學齊魯醫(yī)院(青島)內分泌科,山東青島266011)

摘要〔〕目的探討胰高血糖素樣肽(GLP)-1對肥胖2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島素敏感性的改善作用及機制。方法12只6周齡雄性SD大鼠隨機分為T2DM組、T2DM +GLP-1組及正常對照組(NC組)。T2DM組及T2DM +GLP-1組高脂喂養(yǎng)、NC組普食喂養(yǎng)4 w，給予T2DM組及T2DM +GLP-1組鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg腹腔注射建立T2DM模型。受試大鼠進行高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗。T2DM +GLP-1組大鼠在鉗夾實驗前30 min開始持續(xù)輸注GLP-1，檢測鉗夾實驗120 min葡萄糖輸注率及0、30、60、90、120 min血清胰島素濃度。Wester印跡法測定大鼠腓腸肌絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)磷酸化水平。結果與NC組比較，T2DM組鉗夾實驗120 min葡萄糖輸注率降低(P<0.05),骨骼肌Akt磷酸化水平下降；與T2DM組比較，T2DM +GLP-1組鉗夾實驗120 min葡萄糖輸注率增加(P<0.05)，骨骼肌Akt磷酸化水平升高；各組間胰島素濃度變化無差異(P>0.05)。結論GLP-1可以增加平靜狀態(tài)T2DM大鼠葡萄糖攝取，改善骨骼肌的胰島素敏感性，這一改善作用不依賴于胰島素濃度的增加。

關鍵詞〔〕胰高血糖素樣肽-1；2型糖尿病大鼠；胰島素敏感性；高胰島素-正葡萄糖鉗夾；骨骼肌

1山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院內分泌科

第一作者：王晉竹(1988-),女,在讀碩士,主要從事糖尿病胰島素抵抗的分子機制研究。

胰高血糖素樣肽(GLP)-1作為腸促胰素家族的重要一員，主要通過刺激胰島β細胞分泌胰島素和抑制α細胞分泌胰高糖素發(fā)揮降糖作用，還能增加胰島β細胞數(shù)量、延緩胃排空、抑制食欲、降低血脂、減輕體重、抗炎及保護心血管等，并且能影響機體的胰島素敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，給予胰島素抵抗的肥胖Zucker(fa/fa)大鼠GLP-1類似物治療6 w，可以產生胰島β細胞團及胰島素敏感性均增加的聯(lián)合效應〔1〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)輸注GLP-1能增加急性胰島素抵抗大鼠的骨骼肌微循環(huán)灌注及絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)磷酸化水平，提高骨骼肌對葡萄糖的攝取，增加骨骼肌胰島素敏感性〔2〕。而對于伴有胰島β細胞功能下降、胰島素分泌減少的肥胖2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島素敏感性是否仍有改善作用，目前未見報道。本研究擬探討GLP-1對T2DM大鼠胰島素敏感性的改善作用及機制。

1材料和方法

1.1實驗動物SPF級成年雄性SD大鼠12只，體重160～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2試劑與儀器GLP-1(7-36)amide(美國Baehem公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；檸檬酸鈉緩沖液(北京Solarbio公司)；50%葡萄糖(天津新鄭股份有限公司)；普通速效胰島素(禮來蘇州制藥有限公司)；拜耳血糖儀及配套拜安康試紙(德國Bayer公司)；胰島素酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；抗Akt及其磷酸化抗體(美國Cell Signaling公司)；HRP標記山羊抗兔/鼠IgG(北京鼎國昌盛公司)；多功能凝膠成像化學發(fā)光儀(美國Cell Biosciences公司)；微量注射泵(保定申辰泵業(yè)有限公司)；動物血壓監(jiān)測儀(美國Harvard Apparatus)。

1.3動物模型構建12只6周齡SD大鼠隨機分為T2DM組、T2DM+GLP-1組、正常對照組(NC組)，每組4只。T2DM組和T2DM+GLP-1組高脂飼料喂養(yǎng)4 w，過夜禁食不禁水12 h，稱體重，STZ以30 mg/kg一次性腹腔內注射，繼續(xù)給予高脂飲食。分別于第3、7天檢測尾靜脈血糖，當隨機血糖≥16.8 mmol/L時，T2DM模型大鼠建造成功。

1.4動物手術大鼠隔夜禁食不禁水。稱重，5%戊巴比妥鈉1.2 mg/kg腹腔內注射。麻醉完全后仰臥位固定，沿頸部中線切開大鼠皮膚，依解剖層次鈍性分離組織，行氣管、左側頸內動脈及雙側頸外靜脈插管。左側頸內動脈插管與連有動態(tài)血壓監(jiān)測儀的戊巴比妥鈉微量注射泵連接；右側頸靜脈插管通過三通管分別連接葡萄糖及胰島素的微量注射泵，T2DM+GLP-1組左側頸靜脈插管連接GLP-1微量注射泵。所有操作完成后將大鼠靜置約30 min左右待麻醉狀態(tài)穩(wěn)定。

1.5高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗鉗夾實驗0 min時測定大鼠動脈血糖，同時以3 mIU·kg-1·min-1的速率持續(xù)輸注胰島素，實驗2 min時以2 μl/min的速率持續(xù)輸注30%葡萄糖，120 min時鉗夾實驗結束。期間每10 min測動脈血糖一次，根據(jù)血糖水平調整葡萄糖輸注速率，維持血糖水平在基礎值10%左右，于0、30、60、90、120 min采集動脈血，離心取上清，-20℃儲存用于測定胰島素水平。T2DM+GLP-1組大鼠于鉗夾實驗前30 min開始以30 pmol·kg-1·min-1速率持續(xù)輸注GLP-1直至實驗結束。實驗過程中根據(jù)動態(tài)血壓適當調整戊巴比妥鈉輸注量，以維持大鼠的麻醉狀態(tài)穩(wěn)定。

1.6血糖及胰島素水平測定采用便攜式血糖儀測定全血血糖，ELISA測定血清胰島素水平。

1.7Western 印跡法測定AKt磷酸化水平用RIPA裂解液提取腓腸肌蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉膜后封閉2 h，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加二抗室溫2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液滴膜，暗室顯影拍照。

1.8統(tǒng)計學分析應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理。三組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2結果

2.1各組大鼠葡萄糖輸注率比較在120 min鉗夾實驗結束時，T2DM組葡萄糖輸注率較NC組降低約54%(P<0.05)；T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率較NC組降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與T2DM組相比，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率增加約51%(P<0.05)，見圖1。

與NC組比較：1)P<0.05；與T2DM組比較：2)P<0.05圖1　各組大鼠葡萄糖輸注率比較

2.2各組大鼠血清胰島素濃度比較T2DM+GLP-1組持續(xù)輸注GLP-1后實驗0 min與-30 min相比胰島素濃度無差異(P>0.05)，各組間同一時間點胰島素濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2　各組大鼠血清胰島素濃度比較

2.3各組大鼠平均動脈血壓比較T2DM+GLP-1組鉗夾實驗-30 min、NC組與T2DM組鉗夾實驗0 min時無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。持續(xù)輸注GLP-1后，T2DM+GLP-1組血壓在鉗夾實驗0 min時較-30 min下降約15%(P<0.01)，見圖3。

與-30 min比較：1)P<0.05圖3　各組大鼠平均動脈壓比較

2.4腓腸肌Akt磷酸化表達T2DM組Akt磷酸化水平較NC組降低約53%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，T2DM+GLP-1組Akt磷酸化水平較NC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；持續(xù)輸注GLP-1干預后，與T2DM組相比，T2DM+GLP-1組Akt磷酸化水平升高了約55%(P<0.01)，見圖4。

與NC組比較：1)P<0.01；與T2DM組比較：2)P<0.01圖4　腓腸肌的磷酸化Akt表達水平比較

3討論

作為近年來治療糖尿病的新一類藥物，GLP-1的生理作用及其機制受到廣泛關注。GLP-1主要通過葡萄糖濃度依賴性促胰島素分泌及抑制胰高血糖素分泌發(fā)揮降糖作用，還能減弱胃腸道蠕動、延緩胃排空、降低食欲和食物攝入，減輕體重〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，給予胰腺部分切除的T2DM大鼠GLP-l受體激動劑Exentin-4能誘導胰島β細胞的再生；采用GLP-1培養(yǎng)新鮮分離的人類胰島可抑制β細胞的凋亡〔4,5〕，提示GLP-1有增加胰島β細胞數(shù)量的作用。多項研究還發(fā)現(xiàn)，GLP-1可以通過增加心肌葡萄糖攝取增強心肌收縮力，改善左心室功能及血管內皮細胞功能紊亂〔6～8〕，從而達到保護心血管的作用。近年來在治療肥胖T2DM患者時發(fā)現(xiàn)，GLP-1能升高血清Ⅲ型腺苷酸環(huán)化酶(AC3)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，降低甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的作用〔9〕。另外，GLP-1還能直接或間接影響免疫功能，產生抗炎作用〔10〕。GLP-1的這些生理作用與改善胰島素抵抗建立了必然的聯(lián)系。Parlevliet等〔11〕給胰島素抵抗大鼠腹腔注射GLP-1受體激動劑4 w后發(fā)現(xiàn)，大鼠基礎肝葡萄糖和極低密度脂蛋白(VLDL)的輸出減少；同時通過高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗發(fā)現(xiàn)胰島素敏感性增加。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以通過改善骨骼肌微循環(huán)灌注增加機體胰島素敏感性〔2，12〕。本實驗結果說明輸注GLP-1對T2DM大鼠胰島素敏感性也有明顯的改善作用。

輸注GLP-1并未產生對T2DM大鼠β細胞的刺激效應，GLP-1干預帶來的大鼠葡萄糖輸注率的增加，并非通過GLP-1刺激β細胞釋放胰島素的作用產生。GLP-1對β細胞的促胰島素釋放作用依賴于升高的葡萄糖濃度。由于受試大鼠實驗過程呈空腹狀態(tài)，鉗夾實驗時通過持續(xù)泵入高濃度胰島素及不斷調節(jié)葡萄糖輸注率使血糖始終維持在基礎水平，故未升高的血糖水平不足以使GLP-1產生刺激β細胞分泌胰島素的作用，說明鉗夾實驗中GLP-1增加肥胖2型糖尿病大鼠的葡萄糖輸注率，并非通過增加胰島素分泌量這一途徑實現(xiàn)的。

骨骼肌是葡萄糖最大的儲存和利用器官，胰島素調節(jié)的葡萄糖利用在骨骼肌占75%～95%。Vincent等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，在給予正常SD大鼠持續(xù)輸注胰島素30 min后骨骼肌微循環(huán)血流量增加，而一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)可抑制胰島素誘導的早期骨骼肌微循環(huán)灌注及一氧化氮合酶(eNOS)的產生，還能抑制部分骨骼肌葡萄糖攝取率，說明骨骼肌的葡萄糖代謝與胰島素介導微血管的開放有關。本課題組對正常大鼠的研究也發(fā)現(xiàn)，輸注GLP-1能改善骨骼肌微循環(huán)灌注及胰島素轉運，有效增加骨骼肌Akt磷酸化水平，并伴有后肢骨骼肌葡萄糖攝取的明顯增加〔2〕。本研究結果顯示，GLP-1干預的T2DM大鼠骨骼肌Akt的磷酸化水平顯著高于GLP-1未干預組。推測在T2DM大鼠，GLP-1也是通過改善骨骼肌微循環(huán)灌注，促進胰島素通過內皮細胞PI3K-Akt-eNOS信號傳導途徑介導骨骼肌微血管開放進行跨內皮轉運，進入骨骼肌間隙與肌細胞膜受體結合，增加骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取和利用〔14〕。

GLP-1對動脈血壓的影響目前結果不完全一致。Barragan等〔15〕報告，GLP-1(7-36)酰胺通過非兒茶酚胺作用機制增加大鼠的平均動脈血壓；Vilsb〔16〕則發(fā)現(xiàn)每天給予GLP-1類似物治療的T2DM患者，動脈血壓有所下降；Cabou等〔17〕進行3 h高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗，并同時持續(xù)注入大鼠側腦室GLP-1受體激動劑，發(fā)現(xiàn)大鼠股動脈血壓降低；Yu等〔18〕在給Dahl鹽敏感型高血壓大鼠注射GLP-1后，血管周圍自主神經(jīng)對乙酰膽堿的反應增加，誘導血管舒張增加。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過對正常和胰島素抵抗大鼠進行GLP-1干預后，骨骼肌微循環(huán)血流灌注量較基礎值顯著提高，但大鼠平均動脈血壓無改變〔2〕。本研究發(fā)現(xiàn)GLP-1干預后平均動脈血壓較未干預前下降，但這一降低作用并未影響鉗夾實驗中葡萄糖輸注率的改善?？紤]肥胖T2DM大鼠的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)處于激活狀態(tài)，血管內皮分泌的縮血管因子較舒血管因子增多，全身血管處于相對收縮狀態(tài)。GLP-1可能是通過與其受體結合激活下游通路信使PKA，活化eNOS，增加NO釋放〔19,20〕，從而糾正血管內皮細胞功能紊亂，起到舒張血管的作用。這一作用獨立于GLP-1對骨骼肌微循環(huán)灌注的改善和胰島素敏感性的增加。

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〔2015-01-08修回〕

(編輯李相軍)

Effects of glucagon-like peptide-1 improving insulin sensitivity in obese type 2 diabetic rats

WANG Jin-Zhu,GE Feng,LOU Ning,etal.

Department of Endocrinology,Qilu Hospital,Shandong University,Qingdao 266011,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of Glucagon-like peptide(GLP)-1acted with insulin sensitivity in obese type 2 diabetic(T2DM)rats.MethodsTwelve SD rats were randomized into T2DM,T2DM+GLP-1 and normal control(NC)groups.Rats of T2DM and T2DM+GLP-1 groups were fed with high fat diet for four weeks.The glucose infusion rate at 120 min and insulin concentration at 0,30,60,90,120 min were measured by Hyperinsulinemic-euglycemic clamps.The gastrocnemius serine/threonine protein kinase(Akt)phosphorylation was measured by Western blot.ResultsCompared with that of NC group,the glucose infusion rate at 120 min of T2DM group was lower〔(3.03±1.39)vs(6.52±1.73)mg·kg-1min-1,P<0.05〕,the skeletal muscle Akt phosphorylation levels of T2DM group was decreased.Compared with that of T2DM group,the glucose infusion rate at 120 min of T2DM+GLP-1 group was raised〔(6.09±1.75)vs(3.03±1.39)mg·kg-1min-1,P<0.05〕,so do the Akt phosphorylation levels of skeletal muscle in T2DM+GLP-1 group.There was no difference of insulin concentration among three groups.ConclusionsGLP-1 increases glucose uptake and improves insulin sensitivity of skeletal muscle in tranquility status of T2DM rats.This action of GLP-1 is not with an increase of blood insulin concentration.

【Key words】Glucagon-like peptide-1;Type 2 diabetic rats;Insulin sensitivity;Hyperinsulinemic-euglycemic clamps;Skeletal muscle

通訊作者：王文匯(1963-),女,教授,博士生導師,主要從事糖尿病胰島素抵抗的分子機制研究。

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81070632)；中華醫(yī)學會糖尿病臨床醫(yī)學科研專項資金(12030490349)

中圖分類號〔〕R587.1〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6984-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.008