沈　薇　隋　璐　趙　慧　王麗媛

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，遼寧　沈陽(yáng)　110034)

?

饑餓誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬發(fā)生及Beclin-1表達(dá)的變化

沈薇隋璐趙慧1王麗媛2

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，遼寧沈陽(yáng)110034)

摘要〔〕目的探討?zhàn)囸I誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN1自噬的發(fā)生及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)的變化。方法培養(yǎng)胃癌細(xì)胞MKN1至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，以無(wú)氨基酸培養(yǎng)液EBSS代替RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)12h后收集細(xì)胞，應(yīng)用Western印跡和定量PCR(qRT-PCR)方法分別檢測(cè)特異性標(biāo)記自噬的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(LC3B)以及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的蛋白和mRNA表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)饑餓誘導(dǎo)后細(xì)胞自噬體的產(chǎn)生。結(jié)果饑餓處理12 h后，Western印跡和qRT-PCR 檢測(cè)LC3B和Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較均明顯增加(P<0.05)。免疫熒光下可見點(diǎn)狀自噬體。結(jié)論饑餓可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN1發(fā)生自噬，Beclin-1與饑餓誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN1的自噬相關(guān)，為進(jìn)一步研究Beclin-1在胃癌細(xì)胞自噬中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞〔〕微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B；自噬；Beclin-1；饑餓；胃癌

1沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院機(jī)能教研室

2沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2008級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生

第一作者：沈薇(1976-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤生物學(xué)行為及其分子機(jī)制研究。

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素和多階段演化的過(guò)程，目前認(rèn)為可能與自噬和凋亡有關(guān)〔1〕。自噬作用是細(xì)胞在饑餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)的蛋白、細(xì)胞器和胞質(zhì)通過(guò)自噬作用被包裹、消化并降解成核苷、氨基酸和脂肪酸循環(huán)利用，合成新的大分子和ATP〔2〕。自噬作用不僅具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，過(guò)度上調(diào)的自噬作用也可以引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，也稱為Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡。自噬作用的調(diào)節(jié)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔3，4〕，細(xì)胞自噬研究可能為惡性腫瘤的治療提供更新的途徑。Beclin-1是近十多年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的與自噬相關(guān)的一種抑癌基因，它通過(guò)誘導(dǎo)自噬而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔5〕，但其在胃癌細(xì)胞自噬中的具體作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究采用Earle′s平衡鹽緩沖液(EBSS)代替培養(yǎng)液處理人胃癌細(xì)胞MKN1，免疫熒光及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬的標(biāo)記蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(LC3B)和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)的變化，以進(jìn)一步探討胃癌中自噬作用的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料胃癌細(xì)胞MKN1由本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清(GFBS)，EBSS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；兔抗人β-actin，Beclin-1單克隆抗體，羊抗人LC3B多克隆抗體，羊抗兔，驢抗羊辣根過(guò)氧化物酶IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green I Master 購(gòu)自日本Takara公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理MKN1細(xì)胞在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至70%～80%細(xì)胞融合，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以EBSS洗3遍后，以EBSS代替RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)(饑餓處理)，并在12 h后收獲細(xì)胞或進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。對(duì)照組細(xì)胞不施加處理因素。

1.3免疫熒光觀察饑餓誘導(dǎo)后自噬體的形成MKN1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，孔內(nèi)事先置入無(wú)菌蓋玻片。取正常對(duì)照細(xì)胞和EBSS培養(yǎng)12 h的細(xì)胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定，10%BSA(0.2% TritonX-100)封閉，加入一抗(LC3B，滴度為1∶1 000)，常溫下孵育2 h，PBS清洗3次，加入熒光標(biāo)記二抗 Alexa488(Invitrogen 公司，1∶800)常溫下孵育1 h，甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)LC3B和Beclin-1 mRNA表達(dá)以Trizol法提取實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度(A260/A280>1.9)。根據(jù)濃度取1 μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。LC3B上游引物5′-CAACATGAGCGAGTTGGTCAAGA-3′，下游引物5′-ACTCACCATGCTGTGCTGGTTC-3′;Beclin-1上游引物5′-ATGCAGGTGAGCTTCGTGTG-3′，下游引物5′-CTGGGCTGTGCTAAGTAATGGA-3′;GAPDH上游引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。以上引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。在無(wú)菌去酶的Eppendorf 管中按照說(shuō)明書將配置好的real-time PCR反應(yīng)液(反應(yīng)總體積為20 μl)離心數(shù)秒，混勻后迅速置入ABI7500熒光定量PCR儀中，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，34個(gè)循環(huán)，加溶解曲線。獲得各樣本待測(cè)基因的Ct值。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，其結(jié)果代表各目的基因表達(dá)的相對(duì)定量，以對(duì)照組作為矯正樣本。

1.5Western印跡檢測(cè)LC3B和Beclin-1表達(dá)收集對(duì)照組、饑餓誘導(dǎo)組細(xì)胞總蛋白，將蛋白煮沸5 min 使其變性，取處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，羊抗LC3B多克隆抗體(1∶500)，兔抗Beclin-1單克隆抗體(1∶500)或兔抗β-actin抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，驢抗羊(1∶2 000)或羊抗兔(1∶2 000)辣根過(guò)氧化物酶IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜，暗室中加入ECL液孵育后，利用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行讀片分析。

2結(jié)果

2.1免疫熒光顯示饑餓誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)自噬體形成熒光顯微鏡下可見，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞均顯現(xiàn)綠色熒光。MKN1細(xì)胞經(jīng)饑餓處理12 h后，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀聚集的自噬體，而對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象(圖1)。

圖1　饑餓誘導(dǎo)MKN1細(xì)胞后自噬體的形成(×40)

2.2實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)LC3B和Beclin-1 mRNA表達(dá)LC3B mRNA 及Beclin-1 mRNA在饑餓處理12 h后表達(dá)(0.982±0.027，0.678±0.031)較對(duì)照組明顯增高(0.463±0.019，0.135±0.056，P<0.05)。

2.3Western印跡檢測(cè)LC3B和Beclin-1蛋白表達(dá)饑餓處理12 h后，與對(duì)照組LSC3BⅡ/LC3BⅠ灰度比值(0.13±0.32)比較，實(shí)驗(yàn)組LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度比值(0.68±0.14)明顯增加(P<0.05)，Beclin-1蛋白表達(dá)在饑餓處理后顯著增高〔(0.56±0.24)vs(1.67±0.15)，P<0.05〕，見圖2。

圖2　饑餓處理后MKN1細(xì)胞LC3B和Beclin-1蛋白表達(dá)

3討論

自噬作用參與多種生理過(guò)程中，在應(yīng)激或饑餓狀態(tài)下，可通過(guò)分解胞質(zhì)內(nèi)生物大分子為自身生存提供所需營(yíng)養(yǎng)，也是清除細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)半衰期蛋白、衰老細(xì)胞器和受損結(jié)構(gòu)的主要分子過(guò)程，還是細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的一種防御機(jī)制。自噬或調(diào)解自噬的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。自噬作用的調(diào)節(jié)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，自噬作用是一種腫瘤抑制機(jī)制。有報(bào)道鼠的胰腺細(xì)胞經(jīng)致癌物質(zhì)誘導(dǎo)后，癌變前期細(xì)胞的自噬及降解能力增加，但當(dāng)形成癌細(xì)胞后自噬能力下降〔4〕。多種腫瘤存在Beclin-1等自噬基因的缺陷，能夠逃避自噬性死亡〔6〕。細(xì)胞自噬研究可能為惡性腫瘤的治療提供更新的途徑。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，LC3B的修飾過(guò)程對(duì)自噬泡的形成起關(guān)鍵作用。LC3B前體形成后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過(guò)加工生成胞質(zhì)可溶性蛋白LC3B-I。當(dāng)自噬發(fā)生的時(shí)候，自噬相關(guān)基因Atg7活化LC3B-Ⅰ，活化的LC3B-Ⅰ被轉(zhuǎn)運(yùn)至E2樣酶Atg3，經(jīng)其泛素化修飾后能夠與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合成膜結(jié)合形式LC3B-Ⅱ〔7〕。由于LC3B-Ⅱ定位于自噬前體和自噬體，因此，目前認(rèn)為L(zhǎng)C3B-Ⅱ是自噬體的標(biāo)志分子〔8〕。饑餓法是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的一種經(jīng)典方法，在肝癌〔9〕、前列腺癌〔10〕等腫瘤細(xì)胞的自噬研究中均有應(yīng)用。本研究顯示細(xì)胞出現(xiàn)多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，即自噬體形成，證實(shí)饑餓可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬發(fā)生。

另外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯增加，LC3B-Ⅱ的含量與自噬泡的數(shù)量成正比關(guān)系〔11〕。因此，通過(guò)Western印跡法來(lái)檢測(cè)LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，可以方便地判斷自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制，從而成為一種量化分析的依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞經(jīng)饑餓誘導(dǎo)后，除了可以觀察到大量點(diǎn)狀聚集的自噬體的形成，同時(shí)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯，這和Mizushima等〔12〕對(duì)GFP-LC3轉(zhuǎn)基因鼠的研究結(jié)果相一致。

Beclin-1是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，其機(jī)制主要是與Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶(PI3K)形成復(fù)合物參與募集胞質(zhì)中含F(xiàn)YVE或PX基序的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成，并引導(dǎo)其它自噬蛋白定位于自噬體膜〔5〕。細(xì)胞過(guò)度表達(dá)Beclin-1可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。Beclin-1在人類卵巢癌中下降了75%，在乳腺癌中下降了50%〔13〕。有報(bào)道上調(diào)Beclin-1的表達(dá)能夠增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞系MKN28凋亡，抑制Beclin-1的表達(dá)則削弱了順鉑的細(xì)胞毒作用〔14〕，提示Beclin-1的低表達(dá)在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用。本研究表明在胃癌細(xì)胞MKN1發(fā)生自噬的同時(shí)，能夠檢測(cè)到自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)的上調(diào)，說(shuō)明Beclin-1表達(dá)上調(diào)與胃癌細(xì)胞自噬關(guān)系密切。

本研究成功采用饑餓法誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN1產(chǎn)生自噬，檢測(cè)了自噬的標(biāo)記蛋白LC3B的變化，建立了胃癌自噬的細(xì)胞模型。同時(shí)檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)變化，結(jié)果顯示Beclin-1與胃癌細(xì)胞的自噬相關(guān)。這為進(jìn)一步研究自噬對(duì)胃癌細(xì)胞活性的影響及自噬的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)4

1Xie B，Zhou J，Shu G，etal.Restoration of klotho gene expression induces apoptosis and autophagy in gastric cancer cells：tumor suppressive role of klotho in gastric cancer〔J〕.Cancer Cell Int，2013;13(1)：2867-73.

2Kuma A，Hatano M，Matsui M，etal.The role of autophagy during the early neonatal starvation period〔J〕.Nature，2004;432(7020)：1032-6.

3Yan CH，Liang ZQ，Gu ZL，etal.Contributions of autophagic and apoptotic mechanisms to CrTX2 induced death of K562 cells〔J〕.Toxicon，2006;47(5)：521-30.

4Zheng HY，Zhang XY，Wang XF，etal.Autophagy enhances the aggressiveness of human colorectal cancer cells and their ability to adapt to apoptotic stimulus〔J〕.Cancer Biol Med，2012;9(2)：105-10.

5Chen Z，Li Y，Zhang C，etal.Downregulation of Beclin 1 and impairment of autophagy in a small population of colorectal cancer〔J〕.Dig Dis Sci，2013;58(10)：2887-94.

6Graf MR，Jia W，Johnson RS，etal.Autophagy and the functional roles of Atg5 and beclin-1 in the anti-tumor effects of 3beta and rostene 17alpha diol neurosteroid on malignant glioma cells〔J〕.Steroid Biochem Mol Biol，2009;115(35)：137-45.

7Kroemer G，Marino G，Levine B.Autophagy and the integrated stress response〔J〕.Mol Cell，2010;40(2)：280-93.

8Bellu AR，Kiel JA.Selective degradation of peroxisomes in yeasts〔J〕.Microsc Res Tech，2003;61(2)：161-70.

9Tang H，Da L，Mao Y，etal.Hepatitis B virus X protein sensitizes cells to starvation-induced autophagy via up-regulation of beclin-1 expression〔J〕.Hepatology，2009;49(1)：60-71.

10DiPaola RS，Dvorzhinski D，Thalasila A，etal.Therapeutic starvation and autophagy in prostate cancer：a new paradigm for targeting metabolism in cancer therapy〔J〕.Prostate，2008;68(16)：1743-52.

11Tanida I，Ueno T，Kominami E.LC3 conjugation system in mammalian autophagy〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2004;36(12)：2503-18.

12Mizushima N，Yamamoto A，Matsui M，etal.In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker〔J〕.Mol Biol Cell，2004;15(3)：1101-11.

13Liang C，F(xiàn)eng P，Ku B，etal.Autophagic and tumor suppressor activity of a novel Beclin1-binding protein〔J〕.Nat Cell Biol，2006;8(7)：688-99.

14Furuya D，Tsuji N，Yagihashi A，etal.Beclin-1 augmented cis-diamminedichloroplatinum induced apoptosis via enhancing Caspase-9 activity〔J〕.Exp Cell Res，2005;307(1)：26-40.

〔2014-08-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳杰出青年學(xué)者成長(zhǎng)計(jì)劃(No.LJQ2012091)；沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才啟動(dòng)基金(No.20123041)

中圖分類號(hào)〔〕R730.261〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-6994-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.012