鄒洪波 鄔紅 許川

1983年Johnstone等[1]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟的過程中發(fā)現(xiàn)了一種和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相關(guān)的膜型囊泡（vesicles）被分泌到細(xì)胞外，并在1987年將這種在超速離心下獲得的囊泡命名為外泌體。此后，有研究[2]發(fā)現(xiàn)外泌體中含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等多種成分，并在多個生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。近年來，外泌體在腫瘤中的研究如火如荼。大量研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可通過促進(jìn)肺癌微環(huán)境形成，增加腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力，介導(dǎo)腫瘤免疫抑制，參與放化療抵抗等促進(jìn)肺癌的發(fā)生與發(fā)展。研究外泌體在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用機(jī)制可為肺癌早期有效的診斷和治療提供新的思路。本文對外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展、診斷及治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體概論

1.1 外泌體的生物學(xué)特點和成分 外泌體是源于細(xì)胞“內(nèi)吞-融合-外排”等調(diào)控過程而形成的胞外納米級多泡體（multivesicular bodies, MVBs），在電子顯微鏡下外泌體呈現(xiàn)典型的50 nm-100 nm杯狀或蝶形脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)[3]，蔗糖梯度離心顯示其密度約為1.13 g/mL-1.21 g/mL[4]。利用超速離心法、密度梯度離心法、色譜法、免疫磁珠法等方法可在正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清液、血液、唾液中檢測并分離、純化外泌體[5,6]。由于外泌體起源細(xì)胞不同且成分復(fù)雜，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的分子標(biāo)記物，但有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)四次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、熱休克蛋白70（heat shock protein 70, HSP70）、腫瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101, TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALG-2-interacting protein X, Alix）等可作為外泌體的標(biāo)記物使用。目前已證實外泌體含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等多種活性成分，其中蛋白質(zhì)主要包含粘附蛋白[如：CD9、CD63、CD81、CD166、CD146、整合素）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（如：同線蛋白、網(wǎng)格蛋白）、分子伴侶（如：HSP70、HSP84）、抗原提成蛋白（如：主要組織相容性復(fù)合體I（major histocompatibility complex I, MHC I）和MHC II、CD86]等。脂質(zhì)成分主要含有膽固醇、甘油二酯、鞘磷脂（包括神經(jīng)鞘磷脂和神經(jīng)酰胺）、甘油磷脂（包括卵磷脂、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺）和飽和脂肪酸等。核酸中RNA除信使RNA（messenger RNA, mRNA）和微小RNA（microRNA, miRNA）外，還包括小干擾RNA（small interfering RNA）、穹窿體RNA（vault RNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer ribonucleic acid, tRNA）等非編碼RNA（noncoding RNA, ncRNA）[4,8,9]；DNA除含有單鏈DNA（singlestranded DNA, ssDNA）和線粒體DNA（mitochondrial DNA）外，還包含雙鏈DNA（double-stranded DNA,dsDNA）[10,11]。

1.2 外泌體的生物學(xué)功能 研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為細(xì)胞外微環(huán)境的重要組成部分，可通過旁分泌等途徑釋放進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，并可通過以下途徑在細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)傳遞中發(fā)揮重要作用：①外泌體能作為信號復(fù)合物通過受體介導(dǎo)直接刺激靶細(xì)胞；②外泌體可轉(zhuǎn)運(yùn)膜受體、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、核酸等活性生物成分進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，通過影響靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路，從而改變受體細(xì)胞表型和影響細(xì)胞功能狀態(tài)[12,13]。研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，外泌體不僅能抑制心肌缺血再灌注損傷，還能促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)，并可通過促血管生成促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)。此外，外泌體還具有免疫調(diào)節(jié)等功能[17]。近年來研究[18]證據(jù)表明外泌體在肺癌的發(fā)生與發(fā)展中也扮演重要角色。

2 外泌體在肺癌發(fā)生與發(fā)展中的作用

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）所占比例最高，約為85%[18]，其預(yù)后往往較差，5年生存率＜15%[19]。外泌體作為肺癌細(xì)胞分泌的一種微型囊泡，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。其機(jī)制大致可概括為以下幾點：①促進(jìn)肺癌微環(huán)境形成以增加腫瘤細(xì)胞侵襲能力[18]。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體能通過降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）等形成腫瘤微環(huán)境，由于癌基因的不穩(wěn)定性，使得低氧、酸中毒、饑餓在內(nèi)的微環(huán)境誘導(dǎo)和炎癥免疫反應(yīng)等均能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞釋放外泌體形成腫瘤微環(huán)境[20]。腫瘤微環(huán)境的形成有利于腫瘤細(xì)胞快速生長并增強(qiáng)其運(yùn)動侵襲能力。Zhao等[21]發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞能分泌含氨基酸、脂質(zhì)和三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物等物質(zhì)的外泌體，這些外泌體能在營養(yǎng)匱乏條件下為癌細(xì)胞生存提供必要營養(yǎng)成分。其次，促進(jìn)腫瘤血管生成也可促進(jìn)肺癌演進(jìn)。Liu等[22]發(fā)現(xiàn)使用香煙提取物刺激支氣管上皮細(xì)胞可激活STAT3信號通路，進(jìn)而促使含miR-21的外泌體分泌增加，而含miR-21外泌體的增加將提高血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）水平從而促進(jìn)腫瘤血管的生成并誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Cui等[23]還發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞能分泌含miR-210的外泌體調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞中酪氨酸受體激酶A3（ephrin A3） 水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成以維持腫瘤細(xì)胞的生長。此外，含Rab3D蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta, TGF-β）的外泌體能促進(jìn)上皮細(xì)胞間葉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），增強(qiáng)肺癌細(xì)胞致瘤性和侵襲性[24,25]。Wang等[19]在體外低氧條件下證實了肺癌細(xì)胞能增加含TGF-β和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10, IL-10）的外泌體釋放進(jìn)入腫瘤微環(huán)境提高肺癌細(xì)胞運(yùn)動遷移能力以促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移。②介導(dǎo)肺癌免疫抑制。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)癌癥患者存在免疫缺陷或免疫抑制，而腫瘤細(xì)胞能通過外泌體調(diào)節(jié)腫瘤免疫。其主要是通過攜帶免疫抑制因子并抑制免疫細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞）發(fā)揮的抗腫瘤免疫效應(yīng)，誘導(dǎo)免疫抑制和調(diào)節(jié)細(xì)胞群，例如髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Bregs）等[26,27]，而 MDSCs具有抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力[17]。Chalmin等[28]發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞分泌的含HSP72外泌體能激活STAT3信號通路從而介導(dǎo)MDSCs的免疫抑制作用。此外，外泌體也能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)特定蛋白和RNA進(jìn)入受體細(xì)胞發(fā)揮免疫逃逸作用[29]。③參與肺癌放化療抵抗。肺癌化療耐藥和放療抵抗是肺癌治療失敗的主要原因，研究發(fā)現(xiàn)外泌體能作為腫瘤細(xì)胞排出化療藥物（尤以鉑類和阿霉素類為主）的主要形式而產(chǎn)生化療耐藥，從而大大降低化療療效[30]。Xiao等[31]發(fā)現(xiàn)接觸順鉑的肺癌細(xì)胞能分泌大量的外泌體溝通其他肺癌細(xì)胞并增加其對順鉑的耐藥性，而Li等[32]則發(fā)現(xiàn)使用吉非替尼處理肺癌細(xì)胞后產(chǎn)生的外泌體能拮抗順鉑的化療療效。Choi[33]及Jung等[34]也通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞分泌的外泌體中多種蛋白質(zhì)成分和磷脂成分參與吉非替尼的耐藥性。此外，外泌體也介導(dǎo)放療抵抗。Tang等[35]發(fā)現(xiàn)采用X射線進(jìn)行肺癌放療將誘使含miR-208a外泌體增加，而miR-208a的增加可通過錨定p21基因激活A(yù)KT/mTOR信號通路，進(jìn)而導(dǎo)致肺癌放療抵抗并促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖。此外，Yuan等[36]發(fā)現(xiàn)miR-1246能通過錨定死亡受體5（death receptor 5, DR5）增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放療抵抗。因此，外泌體可通過多途徑參與肺癌的發(fā)生演進(jìn)。

3 外泌體在肺癌診斷中的應(yīng)用

盡管目前低劑量CT（low-dose computed tomography,LDCT）在肺癌高危人群篩查上取得了一定的成就[37]，但仍缺乏精確有效的早期篩查方法，多數(shù)患者確診時已是癌癥晚期，其5年生存率極低。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體不僅與肺癌的發(fā)生演進(jìn)密切相關(guān)，而且在診斷中也發(fā)揮著重要作用：①外泌體RNA在肺癌診斷中的作用。肺癌外泌體RNA水平明顯高于健康者，且RNA水平與肺癌的進(jìn)展程度、治療反應(yīng)、生存率都密切相關(guān)[38]。通過基因芯片、高通量測序法和定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR）等方法發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的miRNA等對NSCLC的診斷有較高價值[39]。其中Roth等[40]發(fā)現(xiàn)血液中的miR-361-3p和miR-625*有助于從良性肺部病變中識別惡性肺癌。而血液中hsa-miR-21的上調(diào)是早期診斷鱗狀細(xì)胞肺癌的可靠生物學(xué)標(biāo)志[41]，肺腺癌患者血液中miR-200b-5p、miR-378、miR-502-5p、miR-629、miR-17和miR-100較肺部肉芽腫患者和健康吸煙者明顯增高[42]。此外，Rodriguez等[43]發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤患者血液中外泌體含有的miR-122-5p等miRNA含量明顯高于支氣管肺泡灌洗液。Munagala等[44]發(fā)現(xiàn)肺癌外泌體中miR-21和miR-155升高對于肺癌復(fù)發(fā)診斷是潛在的生物學(xué)標(biāo)志。②外泌體蛋白質(zhì)在肺癌診斷中的作用。肺癌細(xì)胞分泌的外泌體中富集多種蛋白質(zhì)成分并促進(jìn)肺癌發(fā)生演進(jìn)，是早期診斷肺癌的有效途徑[45]。通過肺癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡分析發(fā)現(xiàn)，外泌體表面高表達(dá)CD317、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）等，這些分子均為診斷NSCLC的可靠生物學(xué)標(biāo)志[46,47]。此外，Li等[48]發(fā)現(xiàn)檢測尿液中外泌體的人富亮氨酸α2糖蛋白1（human leucine-rich α2-glycoprotein 1, LRG1）是診斷NSCLC患者的潛在標(biāo)記物。綜上所述，關(guān)注外泌體及其相關(guān)成分可為探索肺癌早期診斷的分子標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

4 外泌體在肺癌治療中的作用

目前，肺癌的治療以手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療、分子靶向治療的綜合治療為主，但由于各種治療方式均存在局限性及肺癌患者易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的特點，導(dǎo)致患者預(yù)后往往較差。研究發(fā)現(xiàn)，基于外泌體及其相關(guān)成分的研究可為肺癌患者的治療帶來新希望。其依據(jù)大致可概括為以下幾點：①外泌體可增強(qiáng)化療藥物敏感性。Li等[49]發(fā)現(xiàn)肺腺癌中miR-181a能通過錨定人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）抑制EMT，并能增加肺腺癌細(xì)胞對紫杉醇和鉑類化療敏感性。通過使用去乙?；敢种苿ㄈ鏣richostatin A）和去甲基化藥物（如5′aza-deoxycytidine plus）可使表觀沉默的miR-512和miR-373活化，繼而增加肺癌細(xì)胞對鉑類的化療敏感性[50]。Aqil等[51]發(fā)現(xiàn)將從植物中萃取的三萜烯化合物雷公藤紅素裝載于外泌體中能抑制肺癌細(xì)胞增殖，并增加化療敏感性和減少毒副作用。②開發(fā)腫瘤疫苗。腫瘤疫苗是一種活性生物前體，而外泌體目前已成為腫瘤疫苗研究的熱點。肺癌細(xì)胞相關(guān)抗原刺激樹突狀細(xì)胞等抗原提成細(xì)胞產(chǎn)生攜帶有特異癌抗原的外泌體[52]，當(dāng)外泌體遷移到區(qū)域淋巴結(jié)，可激活CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，以外泌體為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗可為肺癌治療提供新的思路[53]。例如：III期臨床試驗證實治療性疫苗（belagenpumatucel-L）[54]和TG4010[55]治療可延長NSCLC晚期患者的生存期。此外，脂質(zhì)體疫苗BLP-25[56]和表皮生長因子疫苗（EGF vaccination）[57]和人類黑色素瘤抗原-A3疫苗（MAGE-A3 vaccine）[58]對于NSCLC治療也具有一定療效。③降低外泌體含量。由于肺癌細(xì)胞相關(guān)外泌體介導(dǎo)肺癌發(fā)生與演進(jìn)，采用血液過濾系統(tǒng)（如Aethlon ADAPTTMsystem）去除或減少外周循壞中外泌體含量可為肺癌治療提供新方法[59]。Fabbri等[60]發(fā)現(xiàn)使用中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869能抑制小鼠體內(nèi)外泌體的產(chǎn)生，并減少肺癌的轉(zhuǎn)移。④外泌體可抑制原癌基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)通過外泌體抑制肺癌相關(guān)原癌基因表達(dá)將有效抑制肺癌的發(fā)生進(jìn)展。有研究[61,62]發(fā)現(xiàn)使用RNA干擾技術(shù)（RNA interference, RNAi）能使肺癌相關(guān)原癌基因（如：AKT1、WT1、IGF-1R、NUPR1、LMO3）沉默，并促使肺癌相關(guān)mRNA降解。因此，通過外泌體抑制肺癌相關(guān)致癌基因表達(dá)將有效抑制肺癌的發(fā)生。⑤外泌體可促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。由于肺癌細(xì)胞能通過外泌體分泌生存素抑制肺癌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長，使用生存素基因負(fù)性突變體（Survivin-D53A）可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡，而成為潛在的基因治療藥物[63]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)從姜科植物中提取的β-欖香烯（β-Elemene）能促進(jìn)抑癌基因p53活化并促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[64]。Ma等[65]發(fā)現(xiàn)miR-34a能通過錨定轉(zhuǎn)化生長因子β受體2（transforming growth factor beta receptor II,TGFβR2）抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。⑥外泌體可作為肺癌潛在的治療靶點。肺癌相關(guān)外泌體成分和功能的多樣性為肺癌的治療提供多個潛在治療靶點。如：黑色素瘤相關(guān)基因（mda-9/syntenin）過表達(dá)將促進(jìn)小細(xì)胞肺癌釋放外泌體，通過以黑色素瘤相關(guān)蛋白為靶點設(shè)計新藥將有可能成為肺癌治療新方法[66]。針對II型跨膜絲氨酸蛋白4（transmembrane protease, serine 4, TMPRSS4）的封閉肽或抗體能促使miR-205高表達(dá)和抑制整合素α5水平從而有效降低肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[67]。此外，有學(xué)者[24]發(fā)現(xiàn)從薔薇科植物中提取的地榆素H6能通過抑制TGF-β的活性而抑制肺腺癌的進(jìn)展。Yang等[68]也發(fā)現(xiàn)促進(jìn)外泌體中l(wèi)et-7的表達(dá)是肺癌治療的潛在靶點。因此，圍繞肺癌相關(guān)外泌體的治療研究將為探索肺癌個體化、精準(zhǔn)化治療策略提供新思路。

5 展望

肺癌是威脅人類健康的重大惡性疾病，盡管人們已認(rèn)識到外泌體在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，也圍繞外泌體在肺癌的早期診斷和治療領(lǐng)域中進(jìn)行了大量探索性工作，但外泌體作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分在腫瘤演進(jìn)中的具體作用機(jī)制尚不清楚，外泌體應(yīng)用于肺癌診斷和治療的敏感性和特異性仍有待提高。因此，關(guān)注外泌體在腫瘤演進(jìn)中的作用機(jī)制及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究將為肺癌早期診斷和治療提供更豐富的理論依據(jù)和參考價值。