王樹鵬　宋春來(lái)　于廣池　胡光宇

(集安市公安局，吉林　集安　134200)

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小鼠腦缺氧后P300在海馬結(jié)構(gòu)中表達(dá)變化及其意義

王樹鵬宋春來(lái)1于廣池2胡光宇3

(集安市公安局，吉林集安134200)

〔摘要〕目的探討小鼠腦缺氧后P300在大腦海馬結(jié)構(gòu)中的表達(dá)。方法隨機(jī)將50只昆明系小鼠分成10組，頸部手術(shù)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后1、3、6、12 h、1、3、6、9、12 d處死，采用免疫組化染色方法檢測(cè)P300在海馬結(jié)構(gòu)中表達(dá)變化，應(yīng)用CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)灰度值。結(jié)果P300在腦缺氧3 h后表達(dá)明顯增加。結(jié)論P(yáng)300可作為腦缺氧的早期指標(biāo)，并很可能參與腦缺氧后海馬功能改變。

〔關(guān)鍵詞〕腦缺氧；P300；海馬

1內(nèi)蒙古興安盟突泉縣公安局2長(zhǎng)春市公安局寬城公安分局

3嘉興市公安局

第一作者：王樹鵬(1970-)，男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

P300為分子量大約250 kD的核蛋白，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。作為細(xì)胞核內(nèi)的大蛋白，其蛋白表面存在著與諸多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域〔1，2〕。目前為止，至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400個(gè)蛋白可與P300形成物理性結(jié)合。P300可作為橋接蛋白介導(dǎo)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相結(jié)合，另外，P300還具有賴氨酸乙?；富钚裕赏ㄟ^乙?；M蛋白而調(diào)控轉(zhuǎn)錄〔3，4〕。最近的研究發(fā)現(xiàn)，P300表達(dá)量和活性降低均與人類神經(jīng)細(xì)胞退行性改變相關(guān)聯(lián)。但神經(jīng)細(xì)胞缺氧后P300的表達(dá)改變，國(guó)內(nèi)外卻鮮有報(bào)道。

1材料與方法

1.1動(dòng)物分組及模型建立昆明系雄性小鼠50只，隨機(jī)分為10組，包括腦缺氧實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別于術(shù)后1、3、6、12 h、1、3、6、9、12 d處死。實(shí)驗(yàn)過程中結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.35 g/kg體重)麻醉小鼠，剪毛并消毒頸部皮膚后，沿中線切開皮膚，手術(shù)分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合皮膚后鼠籠飼養(yǎng)。不結(jié)扎頸部動(dòng)脈，但切開頸部皮膚小鼠作為正常對(duì)照組。

1.2方法

1.2.1蘇木素-伊紅(HE)染色腦組織標(biāo)本用10%甲醛溶液固定2 d，采用石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色采用P300一抗進(jìn)行組織化學(xué)染色，按試劑盒說明書應(yīng)用SP法對(duì)腦組織中P300進(jìn)行檢測(cè)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照，對(duì)已知陽(yáng)性的切片做陽(yáng)性對(duì)照。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)平均灰度值采用CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

常規(guī)HE染色可見，腦缺氧3 h后，損傷灶周圍神經(jīng)細(xì)胞尼氏體溶解消失，神經(jīng)細(xì)胞及血管周圍間隙增寬；缺氧1 d后，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象；缺氧3 d后，可見有膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞增生(圖1)。在正常對(duì)照組海馬組織中，P300呈弱表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組海馬組織中P300在傷后3 h表達(dá)量增高，且隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)后持續(xù)增高，缺氧1 d后達(dá)峰值。缺氧0 min、1、4、12 h、1、3、6、9、12、16 d的平均灰度值為165±3.5，178±7.2，157±7.9，159±5.2，136±8.9，91±6.9，76±8.2，79±9.1，73±2.3，71±6.2。

圖1　小鼠大腦缺氧后P300在海馬中的表達(dá)變化(HE，×20)

3討論

P300作為重要的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控因子，在神經(jīng)細(xì)胞退行性變中的重要作用已被眾多學(xué)者所報(bào)道〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)，P300在正常海馬組織中呈一致性弱表達(dá)，提示P300很有可能參與海馬組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的正常轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程。在腦缺氧早期，P300在海馬組織中表達(dá)即發(fā)生變化，P300表達(dá)量增加，很有可能參與腦缺氧早期細(xì)胞代償過程，提示P300可作為腦缺氧的早期診斷指標(biāo)。另外，P300可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控細(xì)胞中眾多基因的表達(dá)，其在海馬組織中隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而呈規(guī)律性增長(zhǎng)，進(jìn)一步說明其在神經(jīng)細(xì)胞退行性變代償過程中發(fā)揮著重要功能。

4參考文獻(xiàn)

1von Mikecz A，Zhang S，Montminy M，etal.CREB-binding protein (CBP)/p300 and RNA polymerase Ⅱ colocalize in transcriptionally active domains in the nucleus〔J〕.J Cell Biol,2000;150(1):265-73.

2Bhattacherjee V，Horn KH，Singh S，etal.CBP/p300 and associated transcriptional co-activators exhibit distinct expression patterns during murine craniofacial and neural tube development〔J〕.Int J Dev Biol,2009;53(7):1097-104.

3Cazzalini O，Sommatis S，Tillhon M，etal.CBP and p300 acetylate PCNA to link its degradation with nucleotide excision repair synthesis〔J〕.Nucleic Acids Res,2014;42(13):8433-48.

4Ni J，Shen Y，Wang Z，etal.P300-dependent STAT3 acetylation is necessary for angiotensin II-induced pro-fibrotic responses in renal tubular epithelial cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2014;35(9):1157-66.

5Viosca J，Lopez-Atalaya JP，Olivares R，etal.Syndromic features and mild cognitive impairment in mice with genetic reduction on p300 activity：differential contribution of p300 and CBP to Rubinstein-Taybi syndrome etiology〔J〕.Neurobiol Dis，2010;37(1):186-94.

6van Deursen JA，Vuurman EF，Smits LL，etal.Response speed，contingent negative variation and P300 in Alzheimer's disease and MCI〔J〕.Brain Cogn，2009;69(3):592-9.

〔2015-01-15修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：胡光宇(1976-)，男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

〔中圖分類號(hào)〕R36

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6366-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.022