張文文　周金慧　金　玥　張金振　趙文　王琳　李熠　趙靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京100093）

2015年國內(nèi)外蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究進(jìn)展（續(xù)）

張文文周金慧金玥張金振趙文王琳李熠趙靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京100093）

（續(xù)《中國蜂業(yè)》2016年第3期）

Du等［10］的研究中，建立起含有糖漿標(biāo)志物的特定色譜和質(zhì)譜的信息的小規(guī)模的數(shù)據(jù)庫，并確定飛行時(shí)間的一種簡(jiǎn)單，快速，有效的超高效液相色譜/四極質(zhì)譜儀（UHPLC/Q-TOF-MS）方法對(duì)摻假蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)。在玉米糖漿、高果玉米糖漿、轉(zhuǎn)化糖漿和大米糖漿的摻假蜂蜜中；多糖、雙果糖酐和2-乙?；秽?3-吡喃葡糖苷用作檢測(cè)標(biāo)記。用所建立的方法，可在30 min內(nèi)快速、便捷地檢測(cè)出摻假糖漿含量大于10%的蜂蜜。

Wang等［11］根據(jù)淀粉糖漿和純蜂蜜高效液相色譜圖中糖類物質(zhì)出峰時(shí)間的不同鑒別糖漿摻假。在糖漿HPLC色譜中，保留時(shí)間為15.25 min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)特征峰，但是在純蜂蜜樣品中，相同的保留時(shí)間上并沒有峰出現(xiàn)。基于單糖、二糖和寡聚糖在色譜圖中聚合度為3～7的色譜峰的原則，淀粉糖漿中的此特征峰被鑒定為低聚糖的聚合度大于5的重疊峰。因此，保留時(shí)間為15.25 min的特征峰可以作為一個(gè)糖漿摻假蜂蜜的HPLC分析標(biāo)記物。開發(fā)的高效液相色譜法應(yīng)用于100多個(gè)商業(yè)蜂蜜的摻假檢測(cè)檢查，該方法的檢測(cè)精度更高，簡(jiǎn)便，成本低，便于應(yīng)用于實(shí)踐中，相關(guān)檢測(cè)機(jī)構(gòu)可以普及HPLC設(shè)備和技術(shù)到蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

Marc Spiteri等［12］使用核磁共振譜（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）耦合合適的定量方法和統(tǒng)計(jì)模型，同時(shí)檢查單花蜜和雜花蜜的真實(shí)性。研究使用一個(gè)涵蓋大部分經(jīng)濟(jì)作物和地理起源的800種蜂蜜基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集，其中典型的植物花蜜標(biāo)記可以用于檢查單花花蜜；通過光譜圖變化建立起雜花蜜標(biāo)簽；通過200種商品蜜的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)比較，確定了糖漿標(biāo)記信號(hào)。雖然該方法只是定性方法，但是相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)糖漿水平在10%以上時(shí)，該方法穩(wěn)定可靠。采用相同的NMR方法，優(yōu)化相關(guān)參數(shù)后進(jìn)行了葡萄糖、果糖、蔗糖和5-羥甲基糠醛定量。

2.5活性成分分析

蜂產(chǎn)品中主要含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素、有機(jī)酸、色素、芳香物質(zhì)的高級(jí)醇、膠質(zhì)物、蜂花粉、激素等。此外，蜂蜜是一種糖類的飽和溶液，其中糖類約占3/4；蜂王漿中蛋白質(zhì)約占干物質(zhì)的50%，10-羥基-癸烯酸（10-HDA）是蜂王漿中所特有的活性物質(zhì)；蜂膠中含有大量的酚酸和黃酮類物質(zhì)等。多年來，使用不同的儀器方法分離檢測(cè)、鑒定分析蜂產(chǎn)品中已知或未知功能的活性成分，確定其在蜂產(chǎn)品中的含量分布，一直是蜂產(chǎn)品活性成分分析研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

Li等［13］開發(fā)NBD-F柱前衍生，高效液相色譜配合熒光檢測(cè)的方法分析蜂蜜中的脯氨酸。為了確定不同蜂蜜樣品中的游離脯氨酸，蜂蜜樣品首先用0.1mM硼酸鹽緩沖溶液作為萃取溶劑進(jìn)行超聲萃取，經(jīng)XDB C18柱（150×4.6 mm內(nèi)徑）分離，水相為甲醇：0.1mM乙酸鈉緩沖液（pH 7.2）：四氫呋喃（900∶95∶5，分別，v/ v/v），有機(jī)相為甲醇，流速1.0 ml/min，運(yùn)行時(shí)間為10 min。該方法的線性范圍為0.15～100.00 μg/ml，檢出限為3.00 mg/kg，回收率大于90%，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%。該方法成功運(yùn)用于實(shí)際樣品中，檢出游離脯氨酸含量為80.5～426.4 mg/kg。

H Kaygusuz等［13］通過蜂蜜中礦物質(zhì)和維生素B2、總酚含量和抗氧化活性表征安納托利亞石楠花蜂蜜。采用電感耦合等離子體-發(fā)射光譜法（ICP-OES）對(duì)20個(gè)蜂蜜樣品中的五種礦物質(zhì)——鈣，鉀，鐵，銅和錳進(jìn)行測(cè)定；采用毛細(xì)管電泳色譜配合熒光檢測(cè)器測(cè)定維生素B2；采用福林-喬卡梯奧法對(duì)總酚含量進(jìn)行測(cè)定；通過銅降低抗氧化能力試驗(yàn)（CUPRAC）和總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS）檢測(cè)蜂蜜的抗氧化能力。石楠花蜂蜜具有較高含量的維生素B2和礦物質(zhì)元素，同時(shí)與橡樹花蜜和板栗花蜜相比，石楠花蜜具有更高的抗氧化能力和錳含量，同時(shí)，采用主成分分析將石楠花蜂蜜與其他蜜源蜂蜜進(jìn)行了區(qū)分。

新西蘭的麥盧卡蜂蜜以其優(yōu)異的抗菌活性而著稱，這主要?dú)w功于其活性成分甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）。MGO是在麥盧卡蜂蜜成熟過程中由二羥基丙酮（Dihydroxyacetone，DHA）通過非酶脫水形成。MGO和DHA化學(xué)穩(wěn)定性不高，易發(fā)生各種獨(dú)特的化學(xué)反應(yīng)，如通過Strecker反應(yīng)生成一個(gè)重要的芳香化合物——2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）。J Ru ckriemen等［15］首次使用液液萃取和氣相色譜-質(zhì)譜分析麥盧卡蜂蜜中的2-AP，使用標(biāo)準(zhǔn)品和人造蜂蜜外標(biāo)法定量。在11個(gè)麥盧卡蜂蜜商業(yè)樣品中，2-AP濃度范圍為0.08～0.45 mg/kg。與非麥盧卡蜂蜜相比，含有MGO濃度大于250 mg/kg的麥盧卡蜂蜜中，2-AP含量也顯著較高。當(dāng)高含量MGO被人工添加到雜花蜂蜜中，37℃溫度下儲(chǔ)存12周后，2-AP濃度增加0.07～0.40 mg/kg，同時(shí)，5-羥甲基糠醛（HMF）濃度相應(yīng)增大。當(dāng)儲(chǔ)存溫度變化時(shí)，2-AP濃度并沒有顯著變化。最終結(jié)果表明，2-AP與MGO的總含量是麥盧卡蜂蜜質(zhì)量控制的一個(gè)重要參數(shù)。

核苷、核苷酸和核酸堿基是存在于蜂王漿（royal jelly，RJ）中的發(fā)揮生理活性和生物活性的三種主要物質(zhì)。Wu等［16］開發(fā)一種HPLC法用于同時(shí)確定在蜂王漿中的核苷酸、核苷和核堿基，并且調(diào)查三種物質(zhì)在新鮮蜂王漿和商品蜂王漿樣品中的含量和分布差別。方法的檢出限和定量限分別為12.2～99.6 ng/L和40.8～289.4ng/L，回收率均近100.9%。除尿酸外，其他化合物均在蜂王漿中被檢測(cè)到。核苷酸、核苷和核堿基的平均含量在新鮮蜂王漿（2682.93 ng/kg）和商品蜂王漿（3152.78 ng/kg）中存在顯著差異，新鮮蜂王漿和商品蜂王漿中普遍存在AMP，腺苷和腺嘌呤，其中新鮮王漿中含量水平較高的是ATP，ADP和AMP，而商品蜂王漿樣品中IMP，尿苷，鳥苷，胸苷的含量相對(duì)較高。所研究的化合物可被用作評(píng)估蜂王漿新鮮度和質(zhì)量的指標(biāo)。

2.6環(huán)境激素

環(huán)境激素主要通過污染食品、飲用水及空氣來威脅人類健康。該類物質(zhì)在環(huán)境中難以分解，易在生物體內(nèi)蓄積，極易通過食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行生物富集，環(huán)境中不易檢測(cè)的微量或衡量環(huán)境激素經(jīng)過3～4個(gè)營養(yǎng)級(jí)的富集即可達(dá)到驚人的濃度。截至目前，已經(jīng)列入環(huán)境激素的化學(xué)物質(zhì)有70余種，其中對(duì)食品和農(nóng)產(chǎn)品污染最為嚴(yán)重、世界各國最為關(guān)注的主要有：制造碳酸醋樹脂的雙酚A（Bisphenol A，BPA）、用于電器產(chǎn)品的多氯聯(lián)苯（Polychorinated biphenyls，PCBs）、農(nóng)藥滴滴涕（Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）、塑料增塑劑中的鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）、鋅、鉛、汞等。蜂產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能受到環(huán)境激素的污染，雖然環(huán)境污染的不斷加重，蜂產(chǎn)品中環(huán)境激素類污染物的分離檢測(cè)成為近兩年來蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全分析領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

氯酚類物質(zhì)（chlorophenols，CPs）是廣泛存在于水環(huán)境中的污染物質(zhì)，其主要來源為工業(yè)排放的廢水和廢棄物的浸出液、農(nóng)藥、消毒劑和防腐劑等。氯酚是多種含氯酸和有機(jī)磷農(nóng)藥的降解產(chǎn)物。2，4-二氯酚，2，4，6-三氯酚和五氯酚等氯酚類化合物毒性高，污染面廣，難以降解，因此被美國環(huán)保局（U.S.Environmental Protection Agency，EPA）和我國國家環(huán)保總局列入優(yōu)先控制污染物的黑名單。Fan等［17］開發(fā)原位生成離子液體-分散液液微萃?。╥n-situ ionic liquid-dispersive liquid╞liquid microextraction，IL-DLLME）作為預(yù)處理方法，高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中氯酚。由親水性離子液體1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸鹽（［C4mim］BF4）和離子交換試劑雙（三氟甲基磺酰）亞胺金屬鹽LiNTf2制得疏水性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酰胺酸鹽（［C4MIM］NTf2）作為從蜂蜜中提取CPs的萃取劑。然后將分析物富集反萃取到40 μl的0.14MmolNaOH溶液中，最后用高效液相色譜法進(jìn)行分析。該方法的富集系數(shù)高，檢測(cè)限為0.8～3.2μg/L，回收率為91.60～114.33%，同時(shí)簡(jiǎn)便、快速、環(huán)保，并且具有較高的提取效率。

BPA在食品包裝領(lǐng)域的用途主要有兩個(gè)方面：（1）制備添加BPA的塑料包裝和容器，使得它們具有耐高溫、抗輻射、防沖擊性等優(yōu)點(diǎn)；（2）添加BPA在金屬容器內(nèi)壁化學(xué)涂層中，防止因內(nèi)容物的接觸而引起的金屬容器腐蝕。因此，BPA被廣泛用于食品級(jí)包裝材料中，并一直廣受人們的青睞。Mir Ali Farajzadeh等［18］開發(fā)一種分散液液微萃取和氣相色譜耦合火焰電離方法檢測(cè)蜂蜜中的酚醛類抗氧化劑和BPA。研究中對(duì)影響萃取效率的主要因素，包括萃取溶劑的類型和量，以及分散溶劑的體積，鹽和pH等主要因素進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證。最佳提取條件下，檢測(cè)限和定量限分別為0.4～4.7 ng/g 和1.3～14ng/g。富集系數(shù)和提取回收率分別在144～186 和72～93%的范圍內(nèi)。方法精密度在添加濃度100 ng/g水平下的進(jìn)行評(píng)價(jià)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為日內(nèi)7.6%（n= 6），日間8.3%（n=4）。所提出的方法已被成功地應(yīng)用到不同的蜂蜜樣品和丁基化羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚等酚醛抗氧化劑和BPA的測(cè)定。

全氟辛烷基磺酸（perfluooroctanesulfonate，PFOS）和全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）是在環(huán)境和食物鏈中發(fā)現(xiàn)的最顯著的全氟化合物（全氟化碳），它們被歸類為持久性和生物蓄積性的物質(zhì)。因?yàn)檫@兩種物質(zhì)在復(fù)雜的食品基質(zhì)中含量非常低，所以他們的分析檢測(cè)非常困難。Magdalena Surma等［19］開發(fā)基于分散固相萃取結(jié)合UHPLC-MS/MS方法檢測(cè)蜂蜜樣品中的PFOA和PFOS。研究中比較了不同類型的吸附劑：基于聚合物聚苯乙烯-二乙烯苯（ENV）的二氧化硅基（PSA，SAX，NH2，F(xiàn)L和C18）和乙腈作為提取溶劑。對(duì)于所有吸附劑，PFOA的回收率為40～84%，PFOS回收率為47～87%。結(jié)果表明，以聚合物ENV作為吸附劑時(shí)PFOA和PFOS獲得最佳回收率84%和87%。結(jié)果表明，固相萃取ENV吸附劑可以成功地應(yīng)用于蜂蜜中PFOA和PFOS的測(cè)定。開發(fā)方法應(yīng)用到從歐洲各個(gè)國家采集的蜂蜜樣品中，檢測(cè)到PFOA的含量范圍為0.103～0.223 ng/g，而PFOS含量低于定量限，并沒有被檢測(cè)到。

MM Gómez-Ramos等［20］使用飛行時(shí)間氣相色譜串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜對(duì)蜂蠟中的環(huán)境污染物進(jìn)行篩選，用于非靶向環(huán)境污染物的調(diào)查以及表征蜂蠟樣品的有機(jī)污染圖案。該方法首先對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行簡(jiǎn)單提取，隨后用耦合飛行時(shí)間氣相色譜的高分辨率質(zhì)譜（GC-TOFMS）在電子轟擊電離（EI）模式下進(jìn)行分離檢測(cè)。進(jìn)行非靶向污染物調(diào)查的篩選方法包括通過反卷積方法對(duì)初始峰值檢測(cè)和匹配具有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第一級(jí)質(zhì)譜EI-MS質(zhì)譜庫。為了獲得進(jìn)一步的確定污染物的結(jié)構(gòu)表征，除了代表離子的分子式，還需要至少另外兩個(gè)具有精確質(zhì)量得分的碎片離子（質(zhì)量誤差＜5ppm）。方法已經(jīng)初步用于鑒定蜂蠟中環(huán)境污染物的化學(xué)基團(tuán)，如鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）和多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等一些常用于GC分析的污染物。

3總結(jié)

2015年已經(jīng)正式發(fā)表的有關(guān)于蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全的文獻(xiàn)主要關(guān)注點(diǎn)仍然在于農(nóng)獸藥殘和重金屬殘留分析，其主要趨勢(shì)是開發(fā)更簡(jiǎn)單、快速、環(huán)保的前處理方法，配合高分辨檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)化合物的高通量分析，更高的靈敏度和分辨率仍然是科研工作者的不斷追求。另外，環(huán)境激素類物質(zhì)是研究蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域新的著眼點(diǎn)，已有關(guān)于鄰苯二甲酸酯、雙酚A、多環(huán)芳烴等環(huán)境污染物的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表。蜂產(chǎn)品中尚不能明確結(jié)構(gòu)或不能準(zhǔn)確定量的具有生物活性的物質(zhì)的分離鑒定也是科研工作者不斷探索的領(lǐng)域。

本文僅列舉了部分具有代表性的相關(guān)文獻(xiàn)，希望對(duì)今后蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究?jī)?nèi)容范圍和深度有幫助。

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