王鳳璐（山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000）

綿羊綠膿桿菌分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)

王鳳璐（山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000）

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源

臨沂市河?xùn)|區(qū)某綿羊飼養(yǎng)場(chǎng)，飼養(yǎng)500余只兩月齡左右的綿山羊突然發(fā)病死亡。病羊以咳嗽，呼吸困難，流膿性鼻液，部分羊腹瀉。以急性死亡為主，2d之內(nèi)死亡12只。發(fā)病率高達(dá)20%，死亡率在16%以上。病死羊腹部膨大，剖檢可見(jiàn)肝臟腫大質(zhì)脆，有局灶性灰白色纖維素性膜，肺水腫，內(nèi)有泡沫，尖葉、心葉肉變，間質(zhì)增寬；脾腫大，包膜增厚；膽囊腫大，膽汁稀?。荒I包膜增厚，有的發(fā)黃，有出血點(diǎn)；腸系膜渾濁，腸系膜淋巴結(jié)腫脹呈索狀，切面灰白色，小腸內(nèi)有稀薄的黃綠色內(nèi)容物；氣管喉頭充血，內(nèi)有泡沫樣黏液；有的皮下有膠凍樣滲出物；膀胱內(nèi)有黃色尿液：腹股溝淋巴結(jié)水腫。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂（購(gòu)自青島高科園海博技術(shù)有限公司）、肉湯培養(yǎng)液（購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司）、SS瓊脂培養(yǎng)基（購(gòu)自北京中海生物科技有限公司）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（購(gòu)自北京陸橋生物科技有限公司）、三糖鐵培養(yǎng)基（購(gòu)自購(gòu)自北京陸橋生物科技有限公司）、細(xì)菌生化常規(guī)微量鑒定管（購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司）等。

1.1.3 藥敏試驗(yàn)紙片

藥敏試紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

20g左右的小白鼠10只，由獸醫(yī)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

SW-WJ-LCU潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)公司制造，編號(hào)A20100107）、FA2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司制造，出廠號(hào)55201，型號(hào)FA2004N）、生化培養(yǎng)箱（北京泰克儀器有限公司制造，型號(hào)LRH-250A）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)YXQ-LS-SU）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 各種培養(yǎng)基的制備

普通瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)液、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基按常規(guī)進(jìn)行配制，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

半固體培養(yǎng)基：在制備普通肉湯培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再加入0.3～0.5%的瓊脂粉混合加熱融化，分裝滅菌，趁熱豎立放置，待凝固后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血液培養(yǎng)基：將普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化高壓滅菌后，待冷至55℃左右加入無(wú)菌的脫纖家兔鮮血5%混合后，傾注于滅菌平皿。待凝固后放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的血液平板4℃保存?zhèn)溆肹1]。

2.1.2 涂片及染色

無(wú)菌操作取病死綿羊的肝臟、心血、腎臟和滲出物及分離培養(yǎng)物涂片，干燥，革蘭氏染色，鏡檢。

2.1.3 分離培養(yǎng)與觀察

無(wú)菌操作取病料肝臟、心血分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂平板培養(yǎng)基、血液瓊脂平板培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長(zhǎng)變化情況。

2.1.4 運(yùn)動(dòng)性觀察

用滅菌的接種針取液體肉湯培養(yǎng)物穿刺半固體培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長(zhǎng)情況。

2.1.5 生化試驗(yàn)

用滅菌的接種針取液體肉湯培養(yǎng)物接種細(xì)菌生化常規(guī)微量鑒定管，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長(zhǎng)發(fā)酵情況。

2.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將以分離菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)24h，應(yīng)用平板稀釋法計(jì)數(shù)含菌量，使其達(dá)到8×108cfu/ml。將小鼠分成2組，每組5只，試驗(yàn)組腹腔注射0.5ml菌液，對(duì)照組腹腔注射0.5ml無(wú)菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)1周，記錄小鼠發(fā)病率和病死率，剖檢死亡小鼠，觀察病變并分離細(xì)菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用紙片平板擴(kuò)散法（K-B法），取純培養(yǎng)物，無(wú)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～18h得到幼齡菌液。取幼齡菌液0.1ml于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，用“T”形涂布棒涂勻，待其稍干后，用無(wú)菌鑷子將藥敏試紙均勻等距貼在培養(yǎng)基表面，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h，觀察并記錄抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑大小作為判定細(xì)菌對(duì)藥物敏感性的標(biāo)準(zhǔn)。

判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑＜10mm為耐藥；抑菌直徑10～15 mm為中度敏感；抑菌直徑＞15 mm為高敏[2]。

3 試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 涂片染色結(jié)果

取培養(yǎng)物涂片固定，經(jīng)革蘭氏染色后觀察，可在顯微鏡下看到中等大小革蘭氏陰性的小桿菌，多單個(gè)存在、少部分成對(duì)存在，未發(fā)現(xiàn)芽胞和無(wú)莢膜。該形態(tài)特征與綠膿桿菌的形態(tài)特征相同。

3.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

病料接種37℃培養(yǎng)24h觀察。結(jié)果該菌在普通培養(yǎng)基生長(zhǎng)出光滑、濕潤(rùn)、微隆起、邊緣整齊的中等大小的菌落，該培養(yǎng)均能產(chǎn)生水溶性的綠色素和熒光素，使培養(yǎng)基呈藍(lán)綠色；血液培養(yǎng)基上菌落周?chē)型该鞯娜苎h(huán)，說(shuō)明該分離菌具有溶血作用；分離菌在肉湯培養(yǎng)基中呈混濁生長(zhǎng)。上部液面呈藍(lán)綠色，表面有白色菌膜形成；在SS瓊脂上也生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)72h后有的菌落中央呈綠棕色；在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，呈白色菌落，培養(yǎng)基呈暗色；三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，試管底部不出現(xiàn)黃色，說(shuō)明該分離菌不能產(chǎn)生硫化氫。以上培養(yǎng)特性與綠膿桿菌的培養(yǎng)特性相同。

3.3 運(yùn)動(dòng)性觀察結(jié)果

在穿刺的半固體培養(yǎng)基中呈放射狀生長(zhǎng)，培養(yǎng)基上層呈綠色，說(shuō)明該分離菌具有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，能產(chǎn)生水溶性的綠色素。

3.4 生化試驗(yàn)結(jié)果

本菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇。尿素水解緩慢，不產(chǎn)生硫化氫和吲哚。能還原硝酸鹽，V-P試驗(yàn)和M.R試驗(yàn)均為陰性。以上結(jié)果與綠膿桿菌的生化試驗(yàn)結(jié)果相同。

3.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠后接種分離菌于10～20h內(nèi)全部死亡，接種小鼠死亡前均出現(xiàn)精神沉郁，身體抖動(dòng)。對(duì)照組觀察7d未見(jiàn)異常。剖檢死亡小鼠可見(jiàn)肝、脾、肺、腎臟明顯腫大；脾臟嚴(yán)重充血，肝臟有出血點(diǎn)，腎臟出血；肺臟充血，皮下有膠凍樣淡綠色滲出液，并能從死亡的小鼠臟器中分離到接種菌。

3.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株對(duì)鹽酸左旋氧氟沙星、乳酸環(huán)丙沙星高敏，對(duì)卡那霉素、丁胺卡那霉素、硫酸銨普霉素、頭孢噻呋鈉、多黏菌素、青霉素、鏈霉素等藥物產(chǎn)生了耐藥。

4 討論

（1）通過(guò)該病的流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢變化以及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果綜合分析，該羊場(chǎng)本次疾病的發(fā)生和流行是由于綠膿桿菌感染引起。

（2）根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)全場(chǎng)發(fā)病羊飲0.5%鹽酸左旋氧氟沙星，連飲3d。全場(chǎng)搞好衛(wèi)生，用百勝30消毒，每日1次。同時(shí)飼喂?fàn)I養(yǎng)豐富的料，該病4d得到了有效的控制。

（3）綠膿桿菌是一種條件性致病菌，對(duì)畜禽的致病力不強(qiáng)，未能引起人們的足夠重視。但是近年來(lái)，有關(guān)綠膿桿菌導(dǎo)致的畜禽疫病日漸增多，應(yīng)引起重視[3]。

（4）從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出，綠膿桿菌對(duì)大多數(shù)藥物產(chǎn)生了耐藥性，因此在臨床治療該病時(shí)應(yīng)盡量做藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選擇有效藥物，以免延誤治療時(shí)機(jī)。

（5）該病預(yù)防主要是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。給予營(yíng)養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)飼料，禁止飼喂霉敗變質(zhì)和被病原微生物污染的飼料，注重環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒。

[1]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第二版）[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2011:19～21.

[2]韓青松,簡(jiǎn)永利,涂宜強(qiáng),等.綠膿桿菌研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué),2012,33（1）:122-124

[3]周學(xué)章,田東林,鄧明旭.雛雞綠膿桿菌病病原菌的分離和鑒定[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2004（3）:19-21.