張娜，廖振勝，黃雅燕，鄭秉得，楊宇成，張學(xué)勤，葉靜*，肖美添*

1(華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門，361021)2(廈門市海洋生物資源綜合利用工程中心，福建 廈門，361021)

瓊脂是來源于江蘺等海洋紅藻中的以半乳糖為主要成分的一種高分子功能性多糖，具有多種陸地來源的多糖所不具備的優(yōu)異性質(zhì)如優(yōu)異的溶膠凝膠特性，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、日用化工、生物工程等領(lǐng)域，是海洋藻類功能性多糖中不可或缺的重要成員[1-3]。隨著瓊脂研究的深入，瓊脂的生物活性和應(yīng)用被不斷拓展，但瓊脂在水中的溶解性較差，對溶解條件要求較為嚴苛，限制了瓊脂的廣泛使用。因此，對瓊脂進行改性進而提高其在水中的溶解性成為瓊脂研究的一個新方向。有學(xué)者采用超聲處理、高壓均質(zhì)處理、加入助溶劑、酸解法、衍生化法等不同的手段對瓊脂進行改性，取得了一定的成果[4-8]。高壓均質(zhì)處理和加入助溶劑的方法工藝簡單靈活，對瓊脂結(jié)構(gòu)影響小，但其改性效果較有限，無法實現(xiàn)工業(yè)化；超聲處理與酸處理法的使用成本低、操作簡便，但會導(dǎo)致瓊脂降解。衍生化法改善瓊脂溶解性效果顯著，根據(jù)需要還可對多糖黏度、凝膠透明度、凝膠溶膠溫度等性質(zhì)進行針對性調(diào)控，是一種極具潛力的瓊脂改性方法。改善瓊脂溶解性，獲得一種簡單、穩(wěn)定的工藝是實現(xiàn)速溶瓊脂工業(yè)化的重要前提。目前，多糖等高分子的改性方法主要有均相改性法和非均相改性法[9-11]，前者需要將多糖溶解后再進行反應(yīng)，其工藝復(fù)雜、操作繁瑣，故多糖改性工藝更多使用的是非均相法體系，反應(yīng)結(jié)束后通過簡單的后處理即可實現(xiàn)產(chǎn)物分離，避免了溶解、醇沉等冗雜步驟，生產(chǎn)效率高。

本文旨在探究不同改性手段對提高瓊脂溶解性的基礎(chǔ)上，篩選出合適的改性方法，并對瓊脂改性工藝進行進一步優(yōu)化，以期獲得一種工藝簡單的高品質(zhì)速溶瓊脂改性工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級瓊脂，綠新(福建)食品有限公司；過氧化氫、一氯乙酸、環(huán)氧丙烷、氫氧化鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；次氯酸鈉、無水乙醇和冰醋酸，西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWCL-5型恒溫磁力攪拌浴，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；WD-1型凝膠強度儀，泉州萬達實驗儀器設(shè)備有限公司；WSB-3A型白度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；XMTD-8222型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Pilot-5-8M型真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；MS7-H550-PRO型加熱磁力攪拌器，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司；FTIR-84紅外光譜儀, 日本Shimadzu公司；AVANCE III 850 MHz核磁共振儀，德國Bruker BioSpin Corp公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 瓊脂衍生化方法比較

1.3.1.1 氧化瓊脂的制備

稱取瓊脂10 g，置于250 mL的燒杯中，加入200 mL去離子水，攪拌分散瓊脂。加入適量氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10，加入1.5 mL過氧化氫或2 mL次氯酸鈉溶液，將燒杯置于30 ℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)4 h。抽濾，去離子水洗滌至中性，冷凍干燥，得氧化瓊脂。

1.3.1.2 羧甲基化瓊脂的制備

稱取瓊脂10 g，置于250 mL的燒杯中，加入70 mL 80%(體積分數(shù))的乙醇溶液，攪拌分散，加入1.0 g氫氧化鈉，將燒杯置于36 ℃水浴鍋中保溫堿化1 h。稱取1.0 g氯乙酸溶于10 mL乙醇中配成氯乙酸-乙醇溶液，堿化完成后使用恒流泵在30 min內(nèi)將氯乙酸-乙醇溶液緩慢泵入燒杯中，在50 ℃條件下反應(yīng)3 h。反應(yīng)完成后用30%乙酸溶液，將反應(yīng)體系pH調(diào)至7，過濾，并用40%(體積分數(shù))乙醇溶液洗滌2次，冷凍干燥，得羧甲基化瓊脂。

1.3.1.3 羥丙基化瓊脂的制備

稱取瓊脂10 g，置于250 mL的燒杯中，加入80 mL 80%(體積分數(shù))的乙醇溶液，攪拌分散，加入2.0 g氫氧化鈉，將燒杯置于36 ℃水浴鍋中恒溫水浴堿化1 h。堿化完成后加入12 mL 1, 2-環(huán)氧丙烷，升溫至50 ℃，恒溫反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后用30%(體積分數(shù))的乙酸溶液將反應(yīng)體系pH調(diào)至7，將產(chǎn)物過濾，并用40%乙醇洗滌2次、產(chǎn)物經(jīng)干燥后制得羥丙基化瓊脂。

1.3.2 羥丙基瓊脂制備的單因素實驗考察

擬對羥丙基化瓊脂制備工藝中的氫氧化鈉用量、反應(yīng)溫度和1, 2-環(huán)氧丙烷用量3個因素進行考察，研究其對改性瓊脂性能指標的影響。

1.3.2.1 氫氧化鈉單因素實驗

以80 mL 80%(體積分數(shù))的乙醇溶液作為反應(yīng)液相，堿化溫度為36 ℃，堿化時間為1 h，反應(yīng)溫度50 ℃，環(huán)氧丙烷用量為瓊脂質(zhì)量的12.5%。考察堿化氫氧化鈉用量為瓊脂質(zhì)量的0%、5%、10%、15%、20%時對產(chǎn)品性能的影響。

1.3.2.2 反應(yīng)溫度單因素實驗

以80 mL 80%(體積分數(shù))的乙醇溶液作為反應(yīng)液相，堿化溫度為36 ℃，堿化時間為1 h，環(huán)氧丙烷用量為瓊脂質(zhì)量的12.5%，堿化氫氧化鈉量為瓊脂質(zhì)量的10%?？疾旆磻?yīng)溫度為30、40、50、60、70 ℃時對產(chǎn)品性能的影響。

1.3.2.3 環(huán)氧丙烷單因素實驗

以80 mL 80%(體積分數(shù))的乙醇溶液作為反應(yīng)液相，堿化溫度為36 ℃，堿化時間為1 h，反應(yīng)溫度為50 ℃，堿化氫氧化鈉量為瓊脂質(zhì)量的10%?？疾飙h(huán)氧丙烷用量為瓊脂質(zhì)量的2.5%、7.5%、12.5%、17.5%、22.5%時對產(chǎn)品性能的影響。

1.3.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化羥丙基瓊脂制備工藝

根據(jù)單因素實驗確定的最優(yōu)條件范圍，以氫氧化鈉用量(A)，反應(yīng)溫度(B)，溶劑乙醇體積分數(shù)(C)為實驗變量，以凝膠強度、溶解溫度和白度為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平實驗，以Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化羥丙基瓊脂制備工藝，實驗方案見表1。除去所考查的3個變量，其余反應(yīng)條件為：溶劑體積為60 mL、堿化溫度為36 ℃、堿化時間1 h、環(huán)氧丙烷用量為瓊脂質(zhì)量的10%、反應(yīng)時間為6 h。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計

1.3.4 衍生化瓊脂性能檢測方法

1.3.4.1 凝膠強度測定

配制100 mL 1%瓊脂溶液，將瓊脂溶液倒入凝膠強度測定杯中，每個測定杯中約25 mL，待形成穩(wěn)定凝膠后，置于凝膠強度儀上測試凝膠強度，每個樣品平行測定3份取平均值[12]。

1.3.4.2 溶解溫度測定

改性瓊脂溶解溫度的測試參照CAO等[13]的方法并在其基礎(chǔ)上進行適當(dāng)改進。取0.5 g樣品置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL去離子水，攪拌使其充分吸水溶脹后，用帶有溫度計的軟木塞塞住瓶口，使溫度計水銀球沒入樣品中，1 ℃/min速率勻速升溫加熱樣品，待樣品完全溶解后，記錄此時溫度，即為樣品溶解溫度，測量3次取平均值。

1.3.4.3 白度測定

將改性瓊脂粉末攪拌均勻后置于白度儀樣品池中，樣品鋪平后壓實，置于白度儀測試臺上測試，測量3次取平均值。

1.3.5 羥丙基瓊脂的表征

1.3.5.1 傅立葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)表征

準確稱量2 mg 干燥羥丙基瓊脂，以質(zhì)量比1∶150將干燥后的待測樣品與溴化鉀混合均勻、壓制成片。將薄片置于紅外光譜儀樣品池中，記錄樣品在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜圖。

1.3.5.2 核磁共振表征(nuclear magnetic resonance, NMR)

分別稱取20 mg瓊脂和羥丙基瓊脂樣品，加入0.5 mL氘代二甲基亞砜，微熱，振搖，使其充分溶解，轉(zhuǎn)移至核磁管中，置于核磁共振儀中測定1H NMR和13C NMR譜圖。

1.3.6 羥丙基瓊脂對飲用型酸奶穩(wěn)定性的影響

1.3.6.1 酸奶生產(chǎn)工藝流程

發(fā)酵流程[14-15]為：

脫脂奶粉10%、蔗糖5%、凈化水40%(均為質(zhì)量分數(shù))→原料混合(50～60 ℃，30 min)→水合(1 h)→均質(zhì)(60～65 ℃，20 MPa)→加熱滅菌(95 ℃，5 min)→冷卻→接種發(fā)酵劑(添加量0.08‰，質(zhì)量分數(shù))→發(fā)酵(41～43 ℃，9 h)→冷卻至18 ℃左右→發(fā)酵基料

調(diào)配流程[14]為：

上述發(fā)酵基料+果膠0.3%+瓊脂/羥丙基瓊脂(0.08%，質(zhì)量分數(shù))+純凈水5%(質(zhì)量分數(shù))→原料混合→20 MPa均質(zhì)→冷藏(4 ℃，24 h)→產(chǎn)品評價

1.3.6.2 持水力的測定[16]

取均勻酸奶樣品，置于已稱定質(zhì)量的100 mL離心管(m1)中，稱定樣品和離心管質(zhì)量m0，以4 000 r/min離心15 min后，取出，靜置10 min。除去管中上清液，并測量殘余樣品質(zhì)量m，持水力通過公式(1)計算：

(1)

1.3.4 黏度的測定[17]

采用BROOKFIELD 黏度計在室溫25 ℃條件下進行測量，選用2# 轉(zhuǎn)子，設(shè)置轉(zhuǎn)速為30 r/min，樣品測量時間為30 s，平行測定3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同改性方法對瓊脂性質(zhì)的影響

由圖1可知，羧甲基化改性后，瓊脂溶解溫度由98 ℃降至82 ℃左右，溶解性顯著改善，這是由于羧甲基優(yōu)異的親水性導(dǎo)致的，而氧化瓊脂溶解溫度只降至95 ℃，這可能是由于瓊脂上可進行氧化反應(yīng)的位點較少，側(cè)鏈氧化提高溶解性的程度較低[18]；羥丙基化法則可將瓊脂溶解溫度降至86 ℃左右，說明羥丙基親水性良好，可能是其基團的空間位阻作用降低了瓊脂分子鏈纏繞程度，讓側(cè)鏈上更多的親水性羥基暴露與水接觸，提高瓊脂溶解性。

圖1 不同衍生化瓊脂的性質(zhì)

瓊脂在溶解后由于側(cè)鏈羥基之間的相互交聯(lián)作用形成凝膠，其凝膠化能力與羥基的數(shù)量和暴露程度有很大關(guān)系[19]。衍生化改性是將瓊脂鏈上的羥基活化后進行親電反應(yīng)得以實現(xiàn)，這個過程以破壞羥基結(jié)構(gòu)為前提，勢必會對瓊脂原有的凝膠強度造成一定的影響。由圖1可以看出，羧甲基瓊脂的凝膠強度最低，為445 g/cm2，其次為羥丙基瓊脂，其強度為590 g/cm2，這可能是由于羧甲基之間形成的氫鍵強度與穩(wěn)定性低于羥基之間氫鍵強度導(dǎo)致，另一方面，羥丙基基團的大空間位阻使羥基之間的交聯(lián)作用弱化，凝膠強度下降。而氧化瓊脂由于氧化程度較低、氧化位點少，其側(cè)鏈羥基所受影響較小，故凝膠強度能維持在708 g/cm2的較高水平。

羧甲基瓊脂與羥丙基瓊脂反應(yīng)后所得樣品白度分別為32.58%與41.23%，均低于瓊脂原有的白度(56.44%)，因堿性條件下，瓊脂由末端羥基出現(xiàn)“剝皮”反應(yīng)，糖單元逐個被剝離，造成瓊脂分子質(zhì)量輕微下降，同時樣品白度降低[20]。氧化法由于使用氧化劑本身具有漂白作用，在一定濃度范圍內(nèi)可破壞瓊脂的發(fā)色基團和色素，使瓊脂樣品白度提高[21]。氧化瓊脂白度為77.29%。

由上述實驗可看出，氧化法雖然在提高瓊脂白度上具有較好的效果，但對提高瓊脂溶解性的改性效果不好；羧甲基化和羥丙基化法均對提高瓊脂溶解性能有較好的效果，但羥丙基化瓊脂的凝膠強度和白度指標均較羧甲基化瓊脂好。綜上，實驗選擇羥丙基化作為改善瓊脂溶解性的主要手段，并對其制備工藝進行進一步優(yōu)化。

2.2 單因素實驗考察

2.2.1 氫氧化鈉用量對羥丙基瓊脂性質(zhì)影響

NaOH用量與羥丙基瓊脂性能的關(guān)系如圖2所示。由圖2可以看出，反應(yīng)不加氫氧化鈉時，羥丙基瓊脂取代度接近0，隨著NaOH用量的升高，取代度逐漸增加；而凝膠強度則先下降后趨于穩(wěn)定，溶解溫度卻隨著堿用量的增大而降低，說明提高堿用量對降低瓊脂的溶解溫度有較好的效果。樣品的白度隨著堿用量的增加先下降，當(dāng)NaOH用量大于10%后，白度呈上升趨勢，說明較高用量的堿對瓊脂的凝膠強度和白度有保護作用[22]。綜合考慮改性瓊脂性能及生產(chǎn)成本，實驗選擇氫氧化鈉的用量為瓊脂質(zhì)量的5%～15%為宜，后續(xù)實驗條件優(yōu)化中選擇氫氧化鈉用量6%。

圖2 氫氧化鈉用量對羥丙基瓊脂性質(zhì)的影響

2.2.2 反應(yīng)溫度對羥丙基瓊脂性質(zhì)的影響

反應(yīng)溫度與羥丙基瓊脂性能的關(guān)系如圖3所示。羥丙基瓊脂的取代度隨反應(yīng)溫度的升高而升高，說明溫度越高，對羥丙基化反應(yīng)越有利，而且取代度越高，羥丙基瓊脂的溶解溫度越低。凝膠強度隨取代度的增加而顯著降低，當(dāng)反應(yīng)溫度在60 ℃以上時，羥丙基瓊脂凝膠強度低于200 g/cm2，應(yīng)用價值較低。此外，隨著反應(yīng)溫度的升高，羥丙基瓊脂白度下降，說明溫度對瓊脂的白度影響較顯著，這可能是因為高溫環(huán)境使瓊脂側(cè)鏈羥基氧化成酮，樣品發(fā)生變色，與羧甲基化反應(yīng)結(jié)果一致。因此，羥丙基化反應(yīng)應(yīng)該控制在較低的反應(yīng)溫度(40～50 ℃)下進行。

圖3 反應(yīng)溫度對羥丙基瓊脂性質(zhì)的影響

2.2.3 環(huán)氧丙烷用量對羥丙基瓊脂性質(zhì)的影響

環(huán)氧丙烷用量與羥丙基瓊脂性能的關(guān)系如圖4所示。隨著環(huán)氧丙烷用量的增加，使瓊脂與環(huán)氧丙烷的有效接觸增強，羥丙基瓊脂的取代度提高。同時，羥丙基瓊脂的溶解溫度和凝膠強度隨著取代度的提高而降低，樣品的白度隨著醚化劑用量的增加而提高，但低用量環(huán)氧丙烷條件下羥丙基瓊脂的白度遠低于瓊脂，這是由于低用量時瓊脂支鏈上的活性羥基不能及時接枝，在堿性條件下末端羥基發(fā)生了“剝皮”反應(yīng)[20]?！皠兤ぁ狈磻?yīng)對瓊脂有降解作用，使瓊脂的白度降低。綜合考慮各因素，環(huán)氧丙烷用量選擇為7.5%～15%。

圖4 環(huán)氧丙烷用量對羥丙基瓊脂性質(zhì)的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 回歸方程的建立及方差分析

采用Design-Expert軟件對表2的結(jié)果進行多元回歸擬合，得到二項式擬合方程如下：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化因素與響應(yīng)值結(jié)果

Y1=79.00-1.5X1-0.12X2-0.87X3+X1X2-0.5X1X3-1.25X2X3-0.88X12+1.87X22+2.38X32

Y2=258.40-60.12X1-70.87X2+40.50X3+46.50X1X2-36.75X1X3-6.75X2X3+5.55X12+51.55X22+26.88X32

Y3=53.18-0.94X1-2.64X2-8.68X3-3.33X1X2-1.12X1X3-3.37X2X3-0.86X12+1.27X22-1.07X32

表3 回歸方程各項方差分析

綜合考慮溶解溫度、凝膠強度和白度，對響應(yīng)面二次回歸方程、三維響應(yīng)面圖及等高線圖進行綜合分析，得出最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度為40 ℃，氫氧化鈉用量為5.97%，乙醇體積分數(shù)為61.15%，考慮實際操作，最終取優(yōu)化條件：反應(yīng)溫度為40 ℃，氫氧化鈉體積分數(shù)為6.0%，乙醇體積分數(shù)為60%，通過3 組重復(fù)實驗得到的實驗值為樣品溶解溫度為(81±1) ℃，凝膠強度為(408±20) g/cm2，白度為(54.13±0.4)%，響應(yīng)面模型預(yù)測值分別為81 ℃，418 g/cm2和56.31%，實測值與預(yù)測值非常接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取條件可行有效。

2.4 羥丙基瓊脂的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 FTIR光譜表征

圖5 瓊脂及羥丙基瓊脂的紅外光譜圖

2.4.2 NMR分析

由于羥丙基瓊脂與瓊脂在紅外譜圖上區(qū)別不明顯，還需通過NMR技術(shù)進一步闡明其結(jié)構(gòu)，瓊脂和羥丙基瓊脂的1H NMR如圖6-a所示。由圖6可以看出，δH3.0～5.5處的峰歸屬于瓊脂結(jié)構(gòu)中糖單元C1～C5位的氫[24]，且該范圍內(nèi)所有峰的化學(xué)位移在瓊脂和羥丙基瓊脂的1H NMR中變化不大，表明羥丙基化后糖單元的氫類型不變。與瓊脂的氫譜相比，羥丙基瓊脂在δH1.10處新增1個多重峰，歸屬為羥丙基上的甲基信號。對比瓊脂與衍生化瓊脂的13C NMR(圖6-b)可發(fā)現(xiàn)，羥丙基瓊脂較瓊脂新增了2個峰，分別為δC20處的甲基和δC56處的次甲基，而羥丙基上亞甲基信號與糖單元上亞甲基信號重疊，無法區(qū)分。由此可見，羥丙基已成功接入瓊脂分子鏈，這與ZHANG等[11]的所報道的結(jié)果相一致，經(jīng)與文獻對比得知，羥丙基基團主要接入瓊脂上1, 3-β-D-半乳糖單元上的C6位。

a-1H NMR譜圖；b-13C NMR譜圖

2.5 羥丙基瓊脂對飲用型酸奶穩(wěn)定性的影響

對比瓊脂和羥丙基瓊脂作為穩(wěn)定劑在飲用型酸奶中的穩(wěn)定性效果(表4)，結(jié)果表明，發(fā)酵后添加瓊脂和羥丙基瓊脂均可以提高酸奶的持水力，改善乳清析出現(xiàn)象，產(chǎn)品口感細膩飽滿。其中，羥丙基瓊脂作為穩(wěn)定劑可以使酸奶具有更高的持水力，而瓊脂作為穩(wěn)定劑，酸奶的表觀黏度更高，說明羥丙基瓊脂對提高酸奶的穩(wěn)定性作用更好。

表4 瓊脂/羥丙基瓊脂對飲用型酸奶穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

本研究在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化羥丙基瓊脂的合成工藝，得到最優(yōu)制備工藝條件為：反應(yīng)溫度為40 ℃，氫氧化鈉用量為6.0%，乙醇體積分數(shù)為60%。通過3 組重復(fù)實驗得到的實驗值分別為樣品溶解溫度(81±1) ℃，凝膠強度為(408±20) g/cm2，白度為(54.13±0.4)%，與預(yù)測值非常接近，實驗所評價的試驗因素和優(yōu)化的試驗參數(shù)準確可靠，確定的各因素較優(yōu)水平范圍真實有效，可用于實際操作。本研究旨在優(yōu)化羥丙基瓊脂提取方法，可為開發(fā)一種簡單的高品質(zhì)速溶瓊脂改性工藝提供理論依據(jù)。