張?jiān)?，王開方，潘龍，陳旭升

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)技術(shù)部教育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)是從土壤中分離得到的一株ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)產(chǎn)生菌，目前它成為ε-PL主要生產(chǎn)菌，其最大合成能力已經(jīng)突破70 g/L[1]。因ε-PL對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌以及酵母均具有很好的抑制作用，故被日本、韓國(guó)、美國(guó)和中國(guó)批準(zhǔn)用于飲料、肉制品、乳制品等食品的防腐與保鮮，是天然食品防腐劑取代化學(xué)食品防腐劑的關(guān)鍵品種[2-6]。

pH值是影響小白鏈霉菌高效合成ε-PL的最關(guān)鍵因素，控制發(fā)酵過(guò)程pH值保持在4.0左右是實(shí)現(xiàn)小白鏈霉菌大量合成ε-PL的先決條件。然而，鏈霉菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的最適pH值一般為中性，例如子囊霉素、達(dá)托霉素合成的最適pH值為6.5和7.0[7-8]。已有的研究結(jié)果顯示，低pH值促進(jìn)S.albulus積累ε-PL主要有兩方面原因：一是低pH值環(huán)境能有效抑制ε-PL分解酶活性。分離純化S.albulus的ε-PL分解酶，其降解活性在≤pH 4.0環(huán)境下幾乎完全喪失[9]，而ε-PL合成酶在該低pH環(huán)境下依舊能保持約20%的催化活性(最適pH 8.5)[10]。二是低pH環(huán)境有利于S.albulus胞內(nèi)積累ATP。ε-PL合成酶催化活性發(fā)揮依賴胞內(nèi)較高濃度ATP積累，而YAMANAKA等[11]發(fā)現(xiàn)在低pH環(huán)境下S.albulusNBRC14147胞內(nèi)ATP濃度明顯高于較高pH值。因此，他們認(rèn)為低pH環(huán)境會(huì)幫助細(xì)胞積累ATP到ε-PL合成酶啟動(dòng)ε-PL合成所需的臨界值，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)ε-PL合成起始。令人遺憾的是，已有的研究?jī)H關(guān)注低pH值對(duì)ε-PL合成起始與降解問(wèn)題，卻忽略了小白鏈霉菌為何能在低pH值條件下進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝？以及低pH值的環(huán)境脅迫對(duì)小白鏈霉菌造成了何種生理代謝改變？

近年來(lái)，隨著系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，微生物響應(yīng)低pH和酸脅迫的生理機(jī)制逐漸被揭示。研究發(fā)現(xiàn)，微生物面對(duì)低pH和酸脅迫環(huán)境時(shí)，首先是保持胞內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài)(限制氫質(zhì)子內(nèi)流、提高質(zhì)子泵活性、產(chǎn)生堿性物質(zhì)消耗氫質(zhì)子等方式)，其次是改變細(xì)胞膜組分以增強(qiáng)其流動(dòng)性，三是改變細(xì)胞內(nèi)代謝，四是產(chǎn)生保護(hù)和修復(fù)大分子等生理變化。由此可見(jiàn)，低pH或酸脅迫往往會(huì)對(duì)微生物造成全局性的生理影響。為此，本文借助比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，考察S.albulusM-Z18在恒化培養(yǎng)方式下響應(yīng)低pH脅迫所做出的全局基因轉(zhuǎn)錄變化，以期揭示低pH環(huán)境脅迫對(duì)S.albulus造成的生理代謝影響。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

S.albulusM-Z18由本實(shí)驗(yàn)室保藏。MS固體培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇20，大豆粉20，瓊脂粉20。種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 50，酵母粉 5，(NH4)2SO410，KH2PO41.36，K2HPO4·3H2O 0.8，ZnSO4·7H2O 0.04，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，pH 6.8。分批發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 60，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.8，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，KH2PO44，pH 6.8。

1.2 試劑和儀器

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit RNA提取試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;UV-2100分光光度計(jì)，優(yōu)尼科儀器有限公司;T&J-Miniskid迷你平行生物反應(yīng)器(1 L×4)，迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.3 分批發(fā)酵

使用迪必爾1 L生物反應(yīng)器進(jìn)行分批發(fā)酵。接種量為8%，裝液量0.7 L，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速使溶氧維持在30%。接種前，分別將溫度、通氣量以及攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為30 ℃，1 m3/(m3·h)，300 r/min。隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵液pH會(huì)自發(fā)下降，用體積分?jǐn)?shù)為25%的氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至所需pH。發(fā)酵過(guò)程中每隔6 h取1次樣，測(cè)定發(fā)酵液中ε-PL濃度、pH、菌體量及殘余葡萄糖濃度。

1.4 樣品制備

在pH 4.0、5.5環(huán)境中對(duì)S.albulusM-Z18進(jìn)行恒化培養(yǎng)，其中具體的實(shí)驗(yàn)方法參考本實(shí)驗(yàn)室之前的報(bào)道[12]。待菌株達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，從發(fā)酵罐中取出20 mL發(fā)酵液，離心去上清液后用9 g/L KCl洗滌2次，最后用液氮處理，保存于-80 ℃冰箱備用。使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取樣品總RNA，質(zhì)檢合格RNA樣品寄送至華大基因生物有限公司完成轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序。

1.5 分析方法

菌體干重(dry cell weight, DCW)測(cè)定：取10 mL發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min離心8 min后棄去上清液并全部抽濾至濾紙上，于105 ℃烘干12 h。隨后，放置在干燥器中冷卻稱取其質(zhì)量，通過(guò)計(jì)算其與濾紙質(zhì)量之差計(jì)算菌體干重。

ε-PL濃度測(cè)定：采用甲基橙比色法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值對(duì)S.albulus M-Z18菌體生長(zhǎng)和ε-PL合成的影響

S.albulusM-Z18作為ε-PL生產(chǎn)菌，在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中pH值會(huì)從6.8自動(dòng)下降至3.0左右，極低的pH嚴(yán)重影響菌株的生長(zhǎng)。當(dāng)在發(fā)酵罐中控制培養(yǎng)基的pH時(shí)，S.albulusM-Z18在pH值3.5以上能很好地維持細(xì)胞生長(zhǎng)，而且細(xì)胞的生物量隨著pH值的增加而增加(圖1-a)。但ε-PL的合成受到pH值的嚴(yán)格調(diào)控，只有在pH≤5時(shí)才會(huì)積累ε-PL，而且隨著pH的降低ε-PL產(chǎn)量逐漸升高(圖1-b)。因此，S.albulusM-Z18發(fā)酵ε-PL過(guò)程需要嚴(yán)格的控制在低pH環(huán)境中。

a-菌體量；b-ε-PL產(chǎn)量

2.2 低pH脅迫條件下S.albulus M-Z18基因表達(dá)差異與分析

本研究通過(guò)恒化培養(yǎng)控制S.albulusM-Z18在不同pH值(5.5、4.0)條件下達(dá)到穩(wěn)態(tài)[溶解氧(dissolved oxygen，DO)、DCW、ε-PL濃度、殘余葡萄糖濃度等基本不變]。這將消除菌株在不同pH值(5.5、4.0)條件下的生長(zhǎng)差異，更好的比較菌株之間生理差異。取穩(wěn)態(tài)時(shí)的樣品提取RNA進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析。

以Q<0.05且基因差異表達(dá)量倍數(shù)在2倍以上為篩選條件，篩選顯著差異表達(dá)基因。結(jié)果如圖2所示，共有3 893個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中1 786 個(gè)上調(diào)顯著基因，2 107個(gè)下調(diào)顯著基因，顯著差異基因數(shù)目占檢測(cè)到基因數(shù)目的53.97%，說(shuō)明S.albulusM-Z18基因表達(dá)發(fā)生了顯著的變化以應(yīng)對(duì)低pH脅迫。

圖2 顯著差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖

pH 5.5和pH 4.0兩個(gè)樣本的GO功能富集分析結(jié)果如圖3所示，差異表達(dá)基因主要集中于生物過(guò)程(biological process)，此外分子功能(molecular function)和細(xì)胞成分(cellular components)也富集了大量的差異表達(dá)基因。生物過(guò)程顯著富集的條目是代謝過(guò)程(metabolic process)、細(xì)胞過(guò)程(cellular process)和單生物代謝過(guò)程(single-orgnism process)。對(duì)pH 5.5和pH 4.0兩個(gè)樣本進(jìn)行KEGG富集分析。由圖4可知差異基因主要集中于代謝(metabolism)這一大類中，其中多數(shù)基因注釋到碳代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)和萜類化合物和聚酮化合物的代謝(metabolism of terpenoids and polyketides)通路上。此外，跨膜運(yùn)輸(membrane transport)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)通路中多數(shù)基因也發(fā)生了顯著差異表達(dá)。總之，S.albulusM-Z18的代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息交互在低pH脅迫環(huán)境中發(fā)生了顯著的差異變化。對(duì)這些代謝通路展開具體分析以探究S.albulusM-Z18響應(yīng)酸脅迫的具體分子機(jī)制。

圖3 顯著差異表達(dá)基因的GO功能分類圖

圖4 顯著差異表達(dá)基因KEGG Pathway分類圖

2.3 S.albulus M-Z18響應(yīng)低pH脅迫生理機(jī)制

2.3.1 糖代謝途徑

糖代謝過(guò)程主要包括糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸途徑。葡萄糖分子活化階段、葡萄糖降解階段和氧化產(chǎn)能階段為糖酵解途徑的三個(gè)階段。如圖5所示，pH 4.0條件下，糖酵解第一、二階段過(guò)程中所有的酶都沒(méi)有顯著上調(diào)，而且己糖激酶[(glk，SAZ_RS 25070(-5.86倍)，SAZ_RS14035(-5.21倍)]顯著下調(diào)，糖酵解途徑的第一、二階段是受到抑制的。在糖酵解的第三階段，即從3-磷酸甘油醛到丙酮酸的過(guò)程需要4個(gè)酶催化，其中3個(gè)酶的表達(dá)顯著上調(diào)[gapA(2.83倍)、eno(6.96倍)、pyk(2.83倍)]，糖酵解的第三階段增強(qiáng)。另外，從丙酮酸到乙酰-CoA途徑的相關(guān)酶基因均顯著上調(diào)。這表明在低pH環(huán)境中丙酮酸的代謝加速，S.albulusM-Z18可能需要大量的ATP供能。

三羧酸循環(huán)作為能量供應(yīng)和物質(zhì)氧化的主要途徑，如圖5所示，檸檬酸合酶(gltA, 3.03倍)和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體[(sucA(2.14倍)、sucB(2.3倍)和(old, 3.03倍)]這兩個(gè)關(guān)鍵酶顯著上調(diào)。此外，琥珀酸脫氫酶[frdB(3.73倍)、frdC(2.3倍)]也顯著上調(diào)，這表明低pH環(huán)境下三羧酸循環(huán)增強(qiáng)，這有助于菌株獲得大量能量抵御酸脅迫。

圖5 糖代謝途徑

戊糖磷酸途徑是NADPH和核糖合成的主要途徑[14]。氧化階段和非氧化階段為戊糖磷酸途徑的兩個(gè)階段。在pH 4.0環(huán)境中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(zwf, 2.3倍)表達(dá)上調(diào)，葡萄糖-6-磷酸內(nèi)脂酶基因(pglS, -13.93倍)卻顯著下調(diào)，推測(cè)低pH條件下S.albulusM-Z18的NADPH合成增加。在非氧化階段，核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶基因(rpiA, 6.32倍)顯著上調(diào)、轉(zhuǎn)酮酶(tktA, -17.03倍)基因大幅下調(diào)，其余基因沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明戊糖磷酸途徑的非氧化階段在低pH環(huán)境下是減弱的。綜上，低pH條件下S.albulusM-Z18通過(guò)增強(qiáng)糖酵解途徑第三階段、戊糖磷酸途徑中NADPH合成、減弱戊糖磷酸途徑非氧化階段，使丙酮酸更多的進(jìn)入檸檬酸循環(huán)以增加糖代謝產(chǎn)能來(lái)應(yīng)對(duì)低pH脅迫。

2.3.2 氧化磷酸化途徑

需氧微生物主要通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP來(lái)進(jìn)行胞內(nèi)的代謝反應(yīng)。完成這一過(guò)程的是電子傳遞鏈，其主要由4種蛋白質(zhì)復(fù)合物組成，分別是復(fù)合體Ⅰ(NADH-Q還原酶)、復(fù)合體Ⅱ(琥珀酸-Q還原酶)、復(fù)合體Ⅲ(泛醌-細(xì)胞色素c還原酶)和復(fù)合體Ⅳ(細(xì)胞色素c氧化酶)。pH 4.0條件下，S.albulusM-Z18呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ和復(fù)合體Ⅳ顯著上調(diào)，這說(shuō)明菌株的呼吸強(qiáng)度增強(qiáng)。pH 4.0條件下ATP合酶的δ亞基(atpH, -6.32倍)、B亞基(atpF, -2.51倍)和C亞基(atpE, -2.71倍)下調(diào)，推測(cè)這些基因的下調(diào)有可能限制酸性條件下H+流入胞內(nèi)防止胞內(nèi)環(huán)境酸化。但總體上來(lái)說(shuō)，低pH條件下氧化磷酸化增強(qiáng)，呼吸產(chǎn)能增加，這將有助于菌株抵御低pH脅迫(表1)。

表1 氧化磷酸化相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.3.3 氨基酸合成途徑

低pH環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)氨基酸合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響如圖6所示。組氨酸是一種堿性氨基酸，它的合成起始物是5-磷酸核糖-1-焦磷酸鹽(phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)。由于戊糖磷酸途徑中的轉(zhuǎn)酮酶(tktA, -17.03倍)基因表達(dá)下調(diào)，非氧化階段主要合成5-磷酸核糖，因此PRPP的合成可能是增強(qiáng)的。從PRPP到組氨酸的合成途徑中4個(gè)基因發(fā)生顯著變化，磷酸核糖-ATP二磷酸酶(hisE, 9.2倍)顯著上調(diào)、磷酸核糖甲酰胺-5-氨基咪唑甲酰胺核糖異構(gòu)酶[(hisA, -2.46倍)、轉(zhuǎn)氨酶(hisC, SAZ_RS43525(-4.6倍)、SAZ_RS12845(-2.64倍)]和組氨酸脫氫酶(hisD, -2.46倍)都顯著下調(diào)。后續(xù)基因顯著下調(diào)可能是合成組氨酸的量太大造成了反饋抑制，組氨酸合成最終可能是增強(qiáng)的。羥基丙酮酸和3P-D-甘油酸是絲氨酸氨基酸家族的合成起始物。由圖6可知，丙氨酸乙醛轉(zhuǎn)氨酶(agxT, -4.2倍)和D-3-磷酸甘氨酸脫氫酶(serA，-15.14倍)都顯著下調(diào)，這將整體限制了絲氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的合成。4-磷酸赤蘚糖是芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的前體物質(zhì)。前文的分析顯示，pH 4.0條件下，S.albulusM-Z18的戊糖磷酸途徑非氧化階段整體減弱，而且從4-磷酸赤蘚糖到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成途徑的多個(gè)基因顯著下調(diào)，這說(shuō)明整個(gè)芳香族氨基酸合成整體減弱。乙酰乳酸合成酶、丙酮酸是丙酮酸族氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)生物合成的限速酶[15]和前體。經(jīng)前文分析，pH 4.0條件下丙酮酸更多的流向糖酵解途徑，而乙酰乳酸合酶(livB, -3.78倍)和2-異丙基蘋果酸合酶(leuA, -4.0倍)也顯著下調(diào)，這使得丙酮酸族氨基酸合成整體上被削弱。雖然后續(xù)合成途徑中酮醇酸還原異構(gòu)酶(livC, 2.2倍)、3-異丙基蘋果酸脫水酶小亞基(leuD, 2.2倍)顯著上調(diào)，但是合成途徑的最后一步，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶[livE, SAZ_RS38250(-3.03倍)、SAZ_RS38655(-3.03倍)和SAZ_RS10355(-2.46倍)]和亮氨酸脫氫酶(leu, -4.92倍)顯著下調(diào)?？傊蚿H條件下丙酮酸族氨基酸的生物合成也會(huì)減弱。天冬氨酸族氨基酸的合成起始物是草酰乙酸，從圖6可知天冬氨酸氧化酶(nadB, -4.59倍)顯著下調(diào)，這將限制了天冬氨酸族氨基酸的合成。天冬氨酸激酶(lysC, 3.71倍)、蘇氨酸合酶(thrC, 3.25倍)和5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(metH, 3.73倍)顯著上調(diào)，天冬氨酸更多的流向蘇氨酸和甲硫氨酸，天冬氨酸的含量可能減少。令人驚訝的是pH 4.0條件下天冬氨酸β-半醛脫氫酶基因(asd)上調(diào)了2 164.77倍，而后續(xù)賴氨酸合成途徑的基因幾乎都發(fā)生下調(diào)，考慮到S.albulusM-Z18只有在低pH條件下大量合成ε-PL，所以賴氨酸的合成一定是增強(qiáng)的。推測(cè)賴氨酸合成途徑酶基因的下調(diào)可能是低pH條件下賴氨酸的大量合成，反饋抑制賴氨酸合成途徑中酶的合成。α-酮戊二酸是谷氨酸族氨基酸(谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸)的前體，低pH條件下谷氨酸合酶[gltB, SAZ_RS13535(4.6倍)、SAZ_RS13540(2.46倍)]和谷氨酸脫氫酶(gdhA, 2.64倍)基因表達(dá)上調(diào)，證明谷氨酸的合成可能增強(qiáng)。而谷氨酰胺酶(glsA, 5.28倍)和谷氨酰胺合酶(glnA, 8倍)也表達(dá)上調(diào)，證明谷氨酰胺與谷氨酸之間轉(zhuǎn)換強(qiáng)度增加，谷氨酰胺合酶的合成也可能增強(qiáng)。谷氨酸、谷氨酰胺是耐酸系統(tǒng)(谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)和谷氨酸-谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng))的底物，其含量增加有助于S.albulusM-Z18在低pH條件下存活。另外，pH 4.0條件下從谷氨酸到精氨酸和脯氨酸的合成途徑多個(gè)基因顯著下調(diào)，精氨酸和脯氨酸的合成可能減弱。綜上，低pH條件下，絲氨酸家族氨基酸、芳香族氨基酸、丙酮酸族氨基酸、天冬氨酸、脯氨酸和精氨酸的合成被削弱，而組氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的合成可能增強(qiáng)。總之，低pH條件下大部分氨基酸合成削弱了，但是堿性氨基酸組氨酸、賴氨酸的合成增強(qiáng)，這將有助于菌株抵御酸脅迫。

圖6 氨基酸合成途徑

2.3.4 細(xì)胞壁肽聚糖合成途徑

細(xì)胞壁作為細(xì)胞最外層的保護(hù)屏障，對(duì)于維持菌體的正常形態(tài)和抵抗?jié)B透壓具有重要作用。在低pH條件下，細(xì)胞壁可以通過(guò)限制H+或酸性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞來(lái)抵御酸脅迫。小白鏈霉菌細(xì)胞壁主要由多層肽聚糖囊狀結(jié)構(gòu)和嵌插、鑲嵌其中的磷壁酸(teichoic acid，TA)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成。作為小白鏈霉菌細(xì)胞壁主要成分——肽聚糖的生物合成可大致分為三個(gè)階段：細(xì)胞質(zhì)中UDP-N-乙酰壁酰五肽(UDP-N-acetylmuramic acid-pentapeptide，UDP-MurNAc-pentapeptide)的合成、細(xì)胞膜中雙糖肽亞單位的形成和胞外肽聚糖鏈的交聯(lián)[16-17]。6-磷酸果糖是肽聚糖合成起始物，UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)和UDP-N-乙酰胞壁酸(UDP-MurNAc)是肽聚糖聚糖鏈的基本組成單位，在低pH條件下，果糖磷酸激酶[scrk, SAZ_RS13190(-2.83倍)、SAZ_RS15195(-4.29倍)]和UDP-N-乙酰壁酸脫氫酶(glmM, -2.3倍)下調(diào)，使得肽聚糖合成整體受限。相較于pH 5.5，UDP-N-乙酰壁氨酰丙氨酸-D-谷氨酸連接酶(murD,-3.89倍)和UDP-N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基吡啶連接酶[murE, SAZ_RS37110(-2.64倍)、SAZ_RS13835(-2.14倍)]下調(diào)，這會(huì)導(dǎo)致UDP-MurNAc-五肽的肽尾合成削弱。此外，低pH時(shí)，磷酸-N-乙酰壁氨酰五肽轉(zhuǎn)移酶(mraY, 2.3倍)和甘氨酸轉(zhuǎn)移酶[femX, SAZ_RS00170(4.93倍)和SAZ_RS41770(4.93倍)]，揭示肽聚糖合成第二階段的增強(qiáng)。令人驚訝的是，關(guān)于肽聚糖交聯(lián)的糖基轉(zhuǎn)移酶、DD-轉(zhuǎn)肽酶和DD-羧肽酶多個(gè)同工酶表現(xiàn)出顯著上調(diào)，說(shuō)明低pH條件下肽聚糖的初級(jí)交聯(lián)、次級(jí)交聯(lián)的速度增加(圖7)。

圖7 細(xì)胞壁肽聚糖合成途徑

2.3.5 細(xì)胞膜脂肪酸合成途徑

脂肪酸的合成可分為兩個(gè)階段：初始反應(yīng)和循環(huán)反應(yīng)。在起始反應(yīng)中，乙酰-CoA羧化酶和丙二酰轉(zhuǎn)移酶首先催化乙酰-CoA形成丙二酸單酰ACP，然后β-酮酰基ACP合成酶Ⅲ催化丙二酸單酰ACP和乙酰ACP縮合形成β-酮?；鵄CP，這些反應(yīng)完成后，脂肪酸的合成進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)階段[18]。循環(huán)反應(yīng)階段是在在Ⅱ型脂肪酸合酶的催化下經(jīng)縮合、β還原、脫水、烯酰還原4個(gè)反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行脂肪酸的合成，每進(jìn)行1次循環(huán)脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度增加2個(gè)碳原子，形成的脂肪酸有4～18個(gè)碳不等。而乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是脂肪酸合成的第一個(gè)限速酶[19]。如圖8所示，pH 4.0條件下，乙酰-CoA羧化酶基因下調(diào)(acc, -2.07倍)，表明在低pH環(huán)境下脂肪酸合成起始反應(yīng)階段受到限制。此外參與脂肪酸循環(huán)反應(yīng)階段的酶也出現(xiàn)不同程度下調(diào)，表明脂肪酸循環(huán)反應(yīng)階段也受到限制。然而?；d體蛋白基因[acp, SAZ_RS36395(10.27倍)、SAZ_RS15400(10.06倍)和SAZ_RS03525(7.73倍)]在pH 4.0條件下顯著上調(diào)，在脂肪酸合成受限的情況下這將有助于增加脂肪酸的合成速度。環(huán)丙烷脂肪酸有助于微生物抵御酸脅迫[20]，在pH 4.0時(shí)，環(huán)丙烷脂肪酰磷脂合酶(cfa, 4.99倍)顯著上調(diào)，表明S.albulusM-Z18可能通過(guò)增加細(xì)胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸含量抵御酸脅迫。此外，在pH 4.0條件下，脂肪酸去飽和酶(desA, 3.23倍)基因上調(diào)，推測(cè)細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度增加。綜上，S.albulusM-Z18脂肪酸合成整體減弱，但是細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的比例、環(huán)丙烷脂肪酸的含量可能增加。

圖8 細(xì)胞膜脂肪酸合成途徑

2.3.6 蛋白質(zhì)和核苷酸修復(fù)分子

分子伴侶對(duì)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)在生理和壓力條件下的正確折疊至關(guān)重要，其可以防止未折疊多肽的聚集和變性多肽的正確再折疊[21]。在低pH環(huán)境中，分子伴侶蛋白DnaK[SAZ_RS39120(8.57倍)、SAZ_RS21050(2.41倍)和SAZ_RS43735(2.04倍)]、DnaJ(2.95倍)和GroES(2.31倍)均表達(dá)上調(diào)，而水解錯(cuò)誤折疊錯(cuò)誤蛋白的Clp蛋白酶基因全部上調(diào)，表明低pH環(huán)境中S.albulusM-Z18修復(fù)折疊錯(cuò)誤蛋白質(zhì)能力的增強(qiáng)(表2)。

在酸脅迫環(huán)境中細(xì)菌DNA通常會(huì)受到損傷，因此細(xì)菌通常有DNA的修復(fù)機(jī)制以保持基因組的完整性。當(dāng)DNA結(jié)構(gòu)有較大損傷或DNA鏈多處嚴(yán)重?fù)p傷會(huì)誘導(dǎo)核苷酸的切除修復(fù)。在低pH環(huán)境中，參與核苷酸片段切除修復(fù)的Uvr A(3.07倍)、UvrB(5.28倍)、DNA聚合酶I(4.5倍)和連接酶(2.81倍)基因表達(dá)上調(diào)，S.albulusM-Z18的核苷酸切除修復(fù)能力增強(qiáng)。而當(dāng)DNA雙鏈發(fā)生斷裂，則需要非同源末端連接的修復(fù)及基因的同源重組。pH 4.0時(shí)，Ku蛋白(11.24倍)、DNA聚合酶(6.11倍)RecA蛋白(6.77倍)這些參與非同源末端連接修復(fù)和同源重組的基因顯著上調(diào)(表2)。綜上，在低pH環(huán)境中S.albulusM-Z18通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)和DNA修復(fù)能力以應(yīng)對(duì)低pH脅迫造成的蛋白質(zhì)和DNA損傷。

表2 蛋白質(zhì)、DNA保護(hù)與修復(fù)相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.3.7 耐酸系統(tǒng)

為了維持胞內(nèi)環(huán)境中pH的穩(wěn)態(tài)，微生物主要通過(guò)阻礙細(xì)胞外H+的進(jìn)入、增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)酸性物質(zhì)的排出和消耗來(lái)實(shí)現(xiàn)。微生物細(xì)胞可以通過(guò)氨基酸脫羧、脫氨反應(yīng)、尿素水解反應(yīng)來(lái)消耗、中和胞內(nèi)的H+。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，在S.albulusM-Z18中存在完整的谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)、谷氨酸-谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)、不完整的賴氨酸脫羧酶系統(tǒng)、胍基丁胺脫亞氨酶系統(tǒng)、尿素酶系統(tǒng)和精氨酸脫氨酶系統(tǒng)。如圖9所示，低pH環(huán)境中尿素酶系統(tǒng)相關(guān)基因顯著上調(diào)，其中尿素酶亞基α(urease subunit alpha ，UreC)、鎳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nickel permease，NixA)上調(diào)了84.64倍和47.97 倍。在低pH環(huán)境中，尿素酶系統(tǒng)可能對(duì)維持胞內(nèi)環(huán)境中pH的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。

圖9 耐酸系統(tǒng)組分

此外，谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)中的谷氨酸脫羧酶(gadB, 2.85倍)、谷氨酸-GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)體[gadC, 3.68倍)、SAZ_RS03735(5.28倍)]，谷氨酸-谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)中的谷氨酰胺酶(glsA, 5.39倍)，胍基丁胺脫亞氨酶系統(tǒng)中的胍基丁胺脫亞氨酶[augA, SAZ_RS39900(7.89倍)、SAZ_RS39905(2.75倍)]在pH 4.0環(huán)境中都顯著上調(diào)。綜上，在低pH環(huán)境中S.albulusM-Z18可能通過(guò)增強(qiáng)多種耐酸系統(tǒng)來(lái)抵御低pH的脅迫。

3 結(jié)論與討論

小白鏈霉菌是工業(yè)生產(chǎn)ε-PL的主要生產(chǎn)菌，其發(fā)酵過(guò)程中pH會(huì)自發(fā)下降至3.0左右，需要流加氨水維持發(fā)酵過(guò)程中pH的穩(wěn)定。通過(guò)不同pH的分批發(fā)酵培養(yǎng)，其可以在pH 3.5及以上的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，這證明S.albulusM-Z18具有較強(qiáng)的酸耐受性。

通過(guò)恒化培養(yǎng)，使得菌體達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)以消除S.albulusM-Z18在不同pH環(huán)境中因比生長(zhǎng)速率造成的生長(zhǎng)差異。取此時(shí)的樣品用于分析菌株在不同pH值(4.0和5.5)下基因轉(zhuǎn)錄的差異。pH 4.0條件下，共有3 893個(gè)基因差異表達(dá)達(dá)到顯著，其中顯著上調(diào)的基因有1 786個(gè)，顯著下調(diào)的基因有2 107個(gè)。GO分析顯示顯著差異表達(dá)基因主要集中于生物過(guò)程，而KEGG分析顯著差異表達(dá)基因集中在代謝途徑。具體分析顯著差異表達(dá)基因富集的代謝途徑，低pH環(huán)境中S.albulusM-Z18通過(guò)增強(qiáng)糖代謝中糖酵解第三階段、三羧酸循環(huán)途徑、氧化磷酸化途徑和戊糖磷酸途徑的氧化階段來(lái)增強(qiáng)能量的合成，這將有助于菌株在低pH條件下存活；pH 4.0條件下大部分氨基酸的合成被削弱，但堿性氨基酸組氨酸和賴氨酸的合成增加了。細(xì)胞壁作為阻礙胞外H+的第一道屏障，據(jù)報(bào)道酸脅迫中細(xì)菌細(xì)胞壁的厚度會(huì)減小[22-23]。轉(zhuǎn)錄組分析顯示pH 4.0條件下S.albulusM-Z18肽聚糖的合成整體上削弱，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但是催化肽聚糖交聯(lián)的酶的基因幾乎全部上調(diào)，推測(cè)菌株可能是通過(guò)增加肽聚糖的組裝速度以維持酸脅迫環(huán)境中完整的細(xì)胞形態(tài)。除了細(xì)胞壁，細(xì)胞膜也是阻礙胞外H+進(jìn)入胞內(nèi)的外界屏障，很多研究報(bào)道顯示微生物在面對(duì)酸脅迫時(shí)，細(xì)胞膜脂肪酸會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變以適應(yīng)不利環(huán)境，這包括增加脂肪酸的不飽和度、平均碳鏈長(zhǎng)度和環(huán)丙烷脂肪酸的含量[24-25]。本文研究發(fā)現(xiàn)，低pH環(huán)境中S.albulusM-Z18關(guān)于合成不飽和脂肪酸、環(huán)丙烷脂肪酸相關(guān)基因顯著上調(diào)，說(shuō)明低pH環(huán)境中S.albulusM-Z18可能改變細(xì)胞膜脂肪酸成分，以適應(yīng)酸脅迫環(huán)境中和外界之間物質(zhì)和信息的交互。低pH脅迫時(shí)往往會(huì)造成微生物中蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤、變性，DNA堿基錯(cuò)配、插入或缺失等損傷。同樣發(fā)現(xiàn)pH 4.0條件下S.albulusM-Z18中分子伴侶、Clp蛋白酶上調(diào)、核苷酸切除修復(fù)和非同源末端連接相關(guān)基因也表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明低pH環(huán)境下蛋白質(zhì)和DNA損傷的修復(fù)增強(qiáng)。胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)對(duì)于耐酸微生物在低pH環(huán)境中維持正常生理生化反應(yīng)具有重要意義。耐酸系統(tǒng)通過(guò)消耗胞內(nèi)的H+、產(chǎn)生堿性物質(zhì)來(lái)維持胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)。革蘭氏陽(yáng)性菌中已報(bào)道的多數(shù)耐酸系統(tǒng)基因在S.albulusM-Z18基因組中都可以找到。pH 4.0條件下，谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)、谷氨酰胺酶-谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)、胍基丁胺脫亞氨酶系統(tǒng)、尿素酶系統(tǒng)和精氨酸脫氨酶系統(tǒng)都發(fā)生不同程度的上調(diào)，其中尿素酶系統(tǒng)相關(guān)基因上調(diào)最為顯著，尿素酶系統(tǒng)可能起著重要的作用。通過(guò)以上研究，確定S.albulusM-Z18有著不同于一般鏈霉菌的酸耐受能力。發(fā)現(xiàn)在低pH環(huán)境中，S.albulusM-Z18可能通過(guò)增強(qiáng)胞內(nèi)代謝產(chǎn)能、堿性氨基酸的合成，改變細(xì)胞膜成分，維持細(xì)胞壁完整性，加強(qiáng)蛋白質(zhì)、DNA損傷修復(fù)的能力，上調(diào)耐酸系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)以應(yīng)對(duì)低酸脅迫。然而，關(guān)于S.albulusM-Z18的耐酸分子機(jī)制還需要進(jìn)一步分子生物學(xué)水平的驗(yàn)證。