劉暢,王嫦娥,盧瑛*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306) 3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海),上海,201306)

肽聚糖(peptidoglycan,PG)廣泛存在于原核生物當(dāng)中,作為細(xì)胞的“骨架”,為維持細(xì)胞形狀和完整性起到關(guān)鍵作用[1]。肽聚糖是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中唯一共有的成分,且在革蘭氏陽性細(xì)胞的細(xì)胞壁中占有更大比例[2-3]。肽聚糖是一個(gè)動(dòng)態(tài)的高分子物質(zhì)[4],其合成過程十分繁瑣,需要多種蛋白質(zhì)和酶參與調(diào)控,不同類型細(xì)菌的肽聚糖所涉及的生物合成方式也有所不同,這是肽聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜的直接原因[5-6]。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和肽聚糖繁多的功能,在藥物研發(fā)[7]、生物信號(hào)[8]以及生物材料[9]等領(lǐng)域都是經(jīng)久不衰的研究熱點(diǎn)[10]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)對(duì)河豚毒素具有消減作用,發(fā)現(xiàn)肽聚糖是乳酸菌消減河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)的關(guān)鍵組分,并且不同類型乳酸菌對(duì)TTX的消減效果具有差異,推測(cè)可能是肽聚糖類型不同的影響[11-12]。由于現(xiàn)有的肽聚糖提取方法時(shí)間長(zhǎng),存在一定的安全隱患,并且未考慮不同類型肽聚糖帶來的差異性,為后續(xù)試驗(yàn)帶來一定的困擾。因此,本研究旨在以3種肽聚糖結(jié)構(gòu)不同的菌株[1][糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,EF):A3α,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,N115):A1γ,棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis,I3):A4α]為研究對(duì)象,對(duì)磷壁酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的去除方法進(jìn)行優(yōu)化和改良,建立高純度肽聚糖的提取制備方法,并進(jìn)一步通過定量檢測(cè)和毒理實(shí)驗(yàn)考察了純化后的肽聚糖對(duì)TTX含量和毒性的消減效果,為肽聚糖的工業(yè)化制備及其對(duì)河豚毒素的毒性消減作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

EF、N115、I3由上海海洋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏;TTX標(biāo)準(zhǔn)品(>99%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),上海生工生物有限公司;鏈酶蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶,Sigma-Aldrich中國(guó)公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器科技有限公司;CR-GIII高速冷凍離心機(jī), 日本日立公司;HS-3垂直混合器,寧波新芝生物科技股份有限公司;PL2002電子天平,瑞士梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;QB-8002微孔板振蕩器,海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滅活乳酸菌體的制備

選取凍存的EF、N115和I3三種乳酸菌,在MRS培養(yǎng)基中活化3次后,于MRS肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,沸水浴1 h滅活,PBS洗滌3次后離心取沉淀備用(6 000 r/min,10 min)。

1.2.2 肽聚糖純化方法優(yōu)化

1.2.2.1 磷壁酸的去除條件優(yōu)化及含量測(cè)定

稱取菌泥0.1 g(濕重)分別進(jìn)行以下處理:加入5 mL 2%(體積分?jǐn)?shù))曲拉通X-114溶液(50 mmol/L pH 6.5 Tris-HCl),4 ℃攪拌過夜[13];加入5 mL的正丁醇,25 ℃攪拌30 min[14];加入5 mL 100 g/L TCA溶液,沸水浴1 h[15]。經(jīng)過上述處理后的菌泥用去離子水洗滌3次,離心取沉淀(6 000 r/min,10 min),采用鉬酸銨法測(cè)定樣品中的磷含量,每組平行3次。

1.2.2.2 脂質(zhì)的去除試劑優(yōu)化及含量測(cè)定

稱取菌泥0.1 g(濕重)分別進(jìn)行以下處理:加入5 mL 50 g/L SDS溶液,混勻后沸水浴25 min,離心后重懸于5 mL 50 g/L SDS溶液,沸水浴15 min,去離子水洗滌至無泡沫[3];加入5 mLV(乙酸鈉)∶V(氯仿)∶V(甲醇)=4∶5∶10溶液,37 ℃振蕩24 h;加入5 mL 丙酮,37 ℃振蕩24 h。采用香草醛法測(cè)定樣品中的脂質(zhì)含量,每組平行3次。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)的酶解方法優(yōu)化及含量測(cè)定

稱取菌泥0.1 g(濕重)分別進(jìn)行以下處理:加入5 mL 3 mg/mL胰蛋白酶溶液(0.1 mol/L,pH 7.5,Tris-HCl),37 ℃搖床振蕩8 h;加入5 mL 1 mg/mL 鏈酶蛋白酶溶液(0.1 mol/L,pH 7.5,Tris-HCl,5 g/L SDS),60 ℃孵育2 h;使用兩種酶聯(lián)合處理。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量,每組平行3次。

1.2.3 肽聚糖制備

參照本研究?jī)?yōu)化后的方法,向滅活菌體中加入100 g/L TCA溶液,沸水浴1 h。取沉淀加入50 g/L SDS溶液,沸水浴25 min,沉淀重懸于50 g/L SDS溶液中,沸水浴15 min,洗滌至無泡沫。加入1 mg/mL 鏈酶蛋白酶溶液,60 ℃孵育2 h,再向沉淀加入5 mL 3 mg/mL胰蛋白酶溶液,37 ℃搖床振蕩8 h。透析72 h,凍干后備用。

1.2.4 肽聚糖表征

1.2.4.1 肽聚糖特異性表征

取肽聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、EF(A3α)、N115(A1γ)、I3(A4α)的肽聚糖凍干樣,配制成1 mg/mL的溶液,測(cè)定200～700 nm處紫外吸收波長(zhǎng)。向肽聚糖中加入200 μg/mL溶菌酶溶液(0.01 mol/L,pH 6.2 PBS)至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,置于37 ℃搖床,間隔1 h測(cè)定450 nm處的吸光度,繪制變化曲線。

1.2.4.2 肽聚糖的結(jié)構(gòu)表征

將肽聚糖凍干粉噴金后,置于掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察。

1.2.5 肽聚糖對(duì)TTX的消減率測(cè)定

將TTX標(biāo)準(zhǔn)品用0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸溶液配制成1 mg/mL的溶液,將5 mg 滅活菌株和肽聚糖凍干樣與20 μg TTX混合至總體積為1 mL,37 ℃恒溫?fù)u床(200 r/min)混合消減1 h,離心取上清液(12 000 r/min,3 min),參考國(guó)標(biāo)GB 5009.206—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中河豚毒素的測(cè)定》進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)實(shí)驗(yàn)。

競(jìng)爭(zhēng)性ELISA樣品中TTX的抑制率和消減率按照公式(1)和公式(2)計(jì)算:

(1)

(2)

式中:A陽性,陽性孔的OD值;A樣品,樣品孔的OD值;A陰性,陰性孔的OD值。

1.2.6 肽聚糖對(duì)TTX毒性的消減效果

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠(19～21 g),購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(中國(guó)上海)。所有實(shí)驗(yàn)程序均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。小鼠在實(shí)驗(yàn)前喂養(yǎng)3 d,在控制溫度(20～25 ℃)下自由飲水。TTX毒性評(píng)價(jià)采用GB 5009.206—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中河豚毒素的測(cè)定》內(nèi)的小鼠生物法。各實(shí)驗(yàn)組3只小鼠,后腹腔分別注射滅活菌株和肽聚糖處理TTX后的上清液1 mL。記錄注射起始時(shí)間和小鼠死亡時(shí)間。TTX毒性根據(jù)各組平均死亡時(shí)間測(cè)定,平均死亡時(shí)間從注射后至小鼠停止呼吸計(jì)算。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,由SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行顯著性分析,由Graphpad Prism 9.0.0軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肽聚糖的提取純化工藝優(yōu)化

2.1.1 磷壁酸的去除條件優(yōu)化

研究表明,氫氟酸處理是常用的去除細(xì)菌中磷壁酸的方法[3],但氫氟酸腐蝕性強(qiáng)且極易揮發(fā),存在安全隱患。為了找到更為安全且適用于多種類型肽聚糖的去除磷壁酸試劑,以3種具有不同類型肽聚糖的乳酸菌(EF:A3α型;N115:A1γ型、I3:A4α型)中磷含量為指標(biāo),考察了3種較為溫和的試劑(100 g/L TCA,正丁醇,曲拉通X-114)對(duì)磷壁酸去除效果的影響。如圖1所示,采用100 g/L TCA處理1 h后的3種菌株肽聚糖的磷含量降低最為顯著,比對(duì)照組降低了93.5%以上;而正丁醇和曲拉通處理組的肽聚糖磷含量殘留較多,下降范圍為2.18%～45.27%。因此,本實(shí)驗(yàn)選取100 g/L TCA沸水浴處理1 h作為磷壁酸去除條件。

圖1 不同處理方式對(duì)3種乳酸菌肽聚糖中磷含量的影響Fig.1 Effect of different treatment methods on phosphorus content in peptidoglycan of three LAB strains

2.1.2 脂質(zhì)的去除試劑優(yōu)化

研究顯示混合有機(jī)試劑[V(乙酸鈉)∶V(氯仿)∶V(甲醇)=4∶5∶10]可以去除菌體中的脂質(zhì),但其處理過程耗時(shí)長(zhǎng),且氯仿試劑較為危險(xiǎn)[16]。因此,本研究選擇了相對(duì)安全的50 g/L SDS和在脫脂中廣泛使用的丙酮作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較。結(jié)果如圖2所示,經(jīng)過50 g/L SDS、丙酮以及混合試劑處理后,3種肽聚糖的脂質(zhì)含量降至54.56～78.09 mg/g,其中50 g/L SDS處理對(duì)菌體的脂質(zhì)去除率為64.13%～70.68%。表明3種試劑的脂質(zhì)去除效果無顯著差異,且對(duì)不同類型肽聚糖中的脂質(zhì)均有較好的去除效果。但丙酮和混合有機(jī)試劑均需處理24 h,而50 g/L SDS僅需處理40 min,故選取50 g/L SDS作為去除脂質(zhì)的方法。

圖2 不同試劑對(duì)3種乳酸菌肽聚糖中脂質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of different reagents on the lipid content of peptidoglycan in three LAB strains

2.1.3 蛋白質(zhì)的酶解方法優(yōu)化

胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶是目前常用的去除肽聚糖上共價(jià)結(jié)合蛋白的2種酶[17]。胰蛋白酶作為一種肽鏈內(nèi)切酶,可以特異性的作用于賴氨酸和精氨酸上的羧基,而鏈霉蛋白酶則作為一種復(fù)合酶,非特異性的切斷肽鍵。本研究對(duì)比了胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶以及2種酶的聯(lián)合使用對(duì)蛋白質(zhì)的去除效果結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯鰧?duì)于EF和I3,兩種酶聯(lián)合處理后的蛋白質(zhì)含量最低,分別為416.72 mg/g和340.29 mg/g,下降了73.28%和67.03%;而N115的聯(lián)合處理后蛋白質(zhì)含量(475.87 mg/g)卻與單獨(dú)酶處理后的蛋白質(zhì)含量接近,無顯著性區(qū)別;由此可見,在選擇酶的種類時(shí)需要考慮肽聚糖類型的差異?？傮w來說,兩種蛋白酶的復(fù)合處理對(duì)肽聚糖中蛋白質(zhì)的去除率優(yōu)于單一酶處理方式。

圖3 不同酶解方式對(duì)3種乳酸菌肽聚糖中 蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis methods on the protein content of peptidoglycan in three LAB strains

2.2 三種肽聚糖的鑒定及其生物學(xué)活性分析

2.2.1 肽聚糖的純度分析與鑒定

為驗(yàn)證去除磷壁酸、脂質(zhì)和結(jié)合蛋白后的肽聚糖純度,制備的3種肽聚糖樣品與肽聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收波譜結(jié)果如圖4-a所示,3種乳酸菌的肽聚糖與肽聚糖標(biāo)品的峰形在200～700 nm內(nèi)基本一致,分別在230、260 nm處有特征吸收峰,無其他雜質(zhì)吸收峰,表明采用優(yōu)化后制備的肽聚糖純度較高。

溶菌酶可以斷裂肽聚糖糖鏈上的β-1,4糖苷鍵,因此可以通過溶菌酶實(shí)驗(yàn)確定肽聚糖的糖鏈在提純過程中是否被破壞,如圖4-b所示,3種肽聚糖在溶菌酶處理后,其在450 nm處的吸光值在30 min內(nèi)顯著下降,在1～4 h后趨于平緩,且溶液逐漸澄清,表明肽聚糖樣品已被完全酶解。由此可見,制備所得3種肽聚糖的糖鏈結(jié)構(gòu)完整。

a-紫外全波長(zhǎng)掃描圖;b-溶菌酶酶解實(shí)驗(yàn)圖

純化制備的A3α型、A1γ型和A4α型肽聚糖的SEM圖像如圖5所示,3種肽聚糖均呈現(xiàn)較為統(tǒng)一的球狀形態(tài),完整性較好,表明肽聚糖提取時(shí)采用的TCA、SDS和復(fù)合蛋白酶處理不會(huì)對(duì)肽聚糖的球殼外形造成明顯損傷,推測(cè)優(yōu)化建立的提取純化方法對(duì)肽聚糖的活性影響應(yīng)該比較小。

a-EF-PG;b-N115-PG;c-I3-PG

2.2.2 肽聚糖對(duì)TTX含量的影響作用

前期研究發(fā)現(xiàn)肽聚糖是乳酸菌消減TTX的關(guān)鍵組分[11],為考察肽聚糖的提取純化工藝是否會(huì)影響乳酸菌對(duì)TTX的消減作用,本研究采用ELISA分析了3種滅活菌體和肽聚糖分別處理前后的TTX含量變化。如圖6-a所示,TTX經(jīng)3種滅活菌體處理后,其含量下降幅度為81.20%～85.06%,經(jīng)3種肽聚糖處理后的下降范圍為78.51%～81.88%,由此可見,純化后的3種肽聚糖對(duì)TTX的消減作用與乳酸菌處理效果接近,表明優(yōu)化后的提取純化工藝不影響肽聚糖的生物活性。

2.2.3 肽聚糖對(duì)TTX毒性的消減效果

經(jīng)過滅活乳酸菌和肽聚糖處理后TTX的含量明顯下降,為進(jìn)一步評(píng)價(jià)肽聚糖對(duì)TTX毒性的影響作用,本研究利用小鼠生物法分析了3種滅活乳酸菌和肽聚糖對(duì)TTX的毒性消減作用,如圖6-b所示,滅活后的3株乳酸菌對(duì)TTX毒性的消減效果最佳的是I3菌株,消減率為87.65%,其肽聚糖(A4α型)對(duì)TTX的毒性消減效果也最好,消減率為93.02%,另外2種肽聚糖(A3α和A1γ型)對(duì)TTX毒性的消減效果也較好,分別為87.30%和89.42%。綜上,制備所得3種肽聚糖對(duì)TTX的毒性和含量的消減效果均較好。

a-含量消減率;b-TTX毒性消減率

3 討論與結(jié)論

目前已有許多肽聚糖提取相關(guān)的研究,PASQUINA-LEMONCHE等[3]使用氫氟酸去除磷壁酸,這種方法對(duì)肽聚糖結(jié)構(gòu)的損傷較小,但氫氟酸具有強(qiáng)揮發(fā)性和腐蝕性,危險(xiǎn)性較大。SCHLEIFER等[1]首先使用TCA去除乳酸菌細(xì)胞壁上的磷壁酸,TCA較氫氟酸安全性更高,但長(zhǎng)時(shí)間的TCA處理會(huì)損傷肽聚糖的結(jié)構(gòu)。為減少TCA對(duì)肽聚糖結(jié)構(gòu)的破壞,付艷茹等[18]探究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TCA以及不同處理時(shí)間和溫度對(duì)乳酸菌細(xì)胞壁中磷壁酸的去除效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 g/L TCA在70 ℃下處理1 h可以達(dá)到最佳的去除效果,在提高TCA對(duì)磷壁酸去除效率的同時(shí)減少了對(duì)肽聚糖結(jié)構(gòu)的破壞。本研究在此基礎(chǔ)上用100 g/L TCA對(duì)不同類型的肽聚糖進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)100 g/L TCA處理對(duì)不同類型肽聚糖中的磷壁酸均有顯著去除效果。除此之外,還有一些新型的去除磷壁酸的試劑[19],如曲拉通X-114和正丁醇,本實(shí)驗(yàn)選用了這兩種新型試劑與TCA進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明在用量相同的情況下,曲拉通X-114和正丁醇并不能達(dá)到100 g/L TCA的去除效果,但這兩種處理方法更加溫和,依然具有一定的應(yīng)用前景。

SDS、丙酮以及氯仿混合溶劑均為去除脂質(zhì)的常用試劑,其中SDS[20]和氯仿混合試劑[21]已經(jīng)在肽聚糖的提取中得到應(yīng)用,而丙酮還尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)3種試劑在相同用量下表現(xiàn)出類似的脂質(zhì)去除效果,但SDS對(duì)比氯仿和丙酮具有較高的安全性,且處理時(shí)間最短,因此選擇SDS作為肽聚糖提取過程中的脂質(zhì)去除試劑。不同種類的蛋白酶對(duì)肽聚糖上結(jié)合蛋白的去除效果已有很多報(bào)道,楊媛等[22]使用胰蛋白酶和α-糜蛋白酶對(duì)嗜酸乳桿菌細(xì)胞壁上的結(jié)合蛋白進(jìn)行酶解來提純肽聚糖。還有研究比較了胰酶、胰酶加堿性蛋白酶和胰酶加核酶3種處理方法對(duì)嬰兒雙歧桿菌的蛋白去除效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰酶加堿性蛋白酶為最佳處理組合[18]。但這些研究?jī)H使用了一種乳酸菌進(jìn)行研究,并未考慮肽聚糖種類不同的情況下不同的蛋白酶選擇,本研究以3種肽聚糖類型不同的乳酸菌為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)肽聚糖類型會(huì)顯著影響蛋白酶的酶解效果。因此,在肽聚糖提取過程中應(yīng)充分考慮肽聚糖類型所帶來的差異,選用最合適的蛋白酶進(jìn)行處理,或直接選用復(fù)合酶處理。

確定TCA-SDS-復(fù)合酶處理工藝后,本研究利用該方法提取制備了3種不同類型的肽聚糖,并分別分析了它們對(duì)TTX含量和毒性的消減效果。如圖7所示,肽聚糖主要是由糖鏈和肽尾組成的,部分肽聚糖還會(huì)出現(xiàn)肽橋,且不同類型肽聚糖的差異主要體現(xiàn)在肽尾和肽橋的部分;A4α肽聚糖單體的肽橋上有1個(gè)天冬氨酸,使該類肽聚糖含有較多的游離氨基[23];而另外兩種肽聚糖中,A3α肽聚糖的肽橋上含有5個(gè)相連的甘氨酸,無游離活性基團(tuán)[24];A1γ肽聚糖則沒有肽橋[25]。本研究顯示不同類型的肽聚糖對(duì)TTX的消減效果都較好,但其中I3菌株的A4α型肽聚糖對(duì)TTX的含量和毒性均有著最高的消減率(85.06%和93.02%)。因此,推測(cè)肽聚糖對(duì)TTX的消減效果很可能與其含有的游離基團(tuán)有關(guān),A4α肽聚糖相比另外兩種肽聚糖擁有更多的游離活性氨基,這可能是其對(duì)TTX消減效果最好的原因所在?，F(xiàn)有研究已經(jīng)探明TTX是一種兩性內(nèi)鹽,其活性基團(tuán)為胍基和羥基,兩者在溶液中分別帶正電和負(fù)電[11]。3種肽聚糖的肽尾末端丙氨酸(D-Ala)含有帶負(fù)電的游離羧基、糖鏈上含有大量的帶負(fù)電羥基,以及A4α肽聚糖上天冬氨酸含有的帶正電氨基,這些基團(tuán)可能通過靜電作用等方式促進(jìn)肽聚糖與TTX的相互結(jié)合,從而使肽聚糖對(duì)TTX產(chǎn)生消減作用,目前肽聚糖與TTX的相互作用方式及其作用位點(diǎn)尚不清晰,有待今后深入研究。

圖7 三種肽聚糖的單體分子結(jié)構(gòu)圖Fig.7 Molecular structure diagram of three types of peptidoglycan monomers

綜上,本研究通過對(duì)肽聚糖提取過程中去除磷壁酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化,選擇低毒性的TCA作為去除磷壁酸的試劑,引入胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶的復(fù)合酶系統(tǒng)去除肽聚糖上的共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì),并確保整個(gè)提取過程的安全性,建立的提取純化方法可以獲得高純度、結(jié)構(gòu)完整和高活性肽聚糖,并且適用于多種類型的肽聚糖。此外,研究發(fā)現(xiàn)制備的3種乳酸菌肽聚糖對(duì)TTX的消減效果非常顯著,其含量去除率>78%,毒性消減率>87%。本研究為未來肽聚糖的產(chǎn)業(yè)化制備及其對(duì)TTX的毒素消減作用機(jī)制研究提供了方法支撐和科學(xué)依據(jù)。