張耀海,陳細(xì)羽,王成秋,焦必寧

1(西南大學(xué)/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所,重慶,400712)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)測(cè)試中心,重慶,400712) 3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑橘類果品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400712)4(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 實(shí)驗(yàn)室,重慶,400712)5(國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心,重慶,400712)

柑橘是世界第一大水果,我國(guó)柑橘種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一[1]。柑橘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,富含類黃酮[2]、酚酸[2]、香豆素[2-3]、類檸檬苦素[4]、類胡蘿卜素[5]、生物堿[6]、肌醇[7]和揮發(fā)性物質(zhì)[8]等多種生物活性成分。近年來(lái),由于沃柑、紅美人、春見(jiàn)、清見(jiàn)、不知火、W默科特、大雅柑等雜柑營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,且兼具橙、橘和柚果的特點(diǎn),發(fā)展迅速,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。沃柑是坦普爾橘與丹西紅橘的雜交種,由以色列培育而成,果肉濃橙色,肉質(zhì)細(xì)嫩化渣,汁多味濃,高糖低酸,果實(shí)風(fēng)味濃郁。該品種采收期長(zhǎng),可從12月底采收至來(lái)年的3月上旬,具有極高的生產(chǎn)價(jià)值,在廣西、云南、四川、重慶等柑橘產(chǎn)區(qū)被大量推廣種植[9]。由于地理位置、環(huán)境條件、生產(chǎn)方式不同,不同產(chǎn)地沃柑的特有生物活性成分具有差異。研究不同產(chǎn)地農(nóng)產(chǎn)品特征差異,進(jìn)而找出根本差異代謝物,能夠?qū)崿F(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品從原料到產(chǎn)品每一步都有跡可循、有源可查[10]。農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源,既可以采用現(xiàn)代信息技術(shù)進(jìn)行全程監(jiān)測(cè)和跟蹤,也可以尋找不同產(chǎn)地農(nóng)產(chǎn)品的特異性差異物,通常包括有機(jī)成分[11-14]、礦物元素[15]、穩(wěn)定性同位素[16]和DNA圖譜[17]等。

作為一種重要的有機(jī)成分,揮發(fā)性成分能夠客觀地反映不同水果品種的風(fēng)味特點(diǎn),是評(píng)價(jià)果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外對(duì)柑橘中揮發(fā)性成分的報(bào)道主要集中于不同品種果皮精油和果汁等之間的差異性分析[18],但不同產(chǎn)地同一品種中揮發(fā)性成分的差異分析及產(chǎn)地溯源研究較少。如SONG等[11]利用GC-FID和GC-MS比較了韓國(guó)和日本不知火雜柑果皮精油中揮發(fā)性成分,檸檬烯、醇類和醛類等主要成分均差異顯著。金潤(rùn)楠等[12]采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS),并結(jié)合氣味活度值和主成分分析(principal component analysis,PCA),對(duì)我國(guó)浙江、湖北、湖南3個(gè)產(chǎn)地的宮川和尾張2個(gè)溫州蜜柑品種果汁中香氣差異進(jìn)行分析比較,結(jié)果表明,產(chǎn)地和品種對(duì)溫州蜜柑香氣成分均有顯著影響,選取產(chǎn)地特異性成分和品種產(chǎn)地特異性成分進(jìn)行PCA,能夠很好地將樣品區(qū)分開(kāi)。CENTONZE等[13]將HS-SPME-GC-MS與電子鼻聯(lián)用,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué),用于區(qū)分來(lái)自意大利、南非和西班牙三地的甜橙品種。羅振玲等[14]分析了來(lái)自浙江省臺(tái)州黃巖、寧波象山、衢州衢江和麗水蓮都等4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的紅美人果皮中主要揮發(fā)性成分的差異性,利用揮發(fā)性成分可基本區(qū)分4個(gè)產(chǎn)區(qū)的紅美人。

本文通過(guò)HS-SPME-GC-MS技術(shù),對(duì)4個(gè)主產(chǎn)地(四川、重慶、云南和廣西)的沃柑果皮中揮發(fā)性成分進(jìn)行定性和半定量分析,并基于半定量結(jié)果分別建立四川和重慶、云南和廣西沃柑的正交偏最小二乘法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)模型,進(jìn)而采用s-plot圖并結(jié)合變量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)值和分析比較成分間的顯著性差異,最終確定能夠區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)沃柑的潛在生物標(biāo)志物,旨在為沃柑的產(chǎn)地溯源和深加工提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沃柑具體采摘信息見(jiàn)表1所示。所有樣品均符合果形端正,較整齊,單果斑點(diǎn)不超過(guò)4個(gè),無(wú)枯水,淺橙黃色且著色均勻。由于產(chǎn)地不同,成熟時(shí)間有一定差異,廣西和云南的沃柑采于2020年1月,四川和重慶的沃柑采于2020年3月。每份樣品不少于30個(gè),將采摘的沃柑表面擦拭干凈,四分法切開(kāi)得到果皮,打碎混勻。

表1 沃柑樣品信息Table 1 Sample information of Orah mandarin

NaCl(分析純),重慶川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠;環(huán)己酮(純度≥99.5%)、C5～C25正構(gòu)烷烴(色譜純),德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH;α-蒎烯(純度98.0%)、月桂烯(純度≥75.0%)、3-蒈烯(純度>90.0%)、α-松油烯(純度>90.0%)、檸檬烯(純度95.0%)、γ-松油烯(純度>95.0%)、異松油烯(純度85.0%)、順式-3-己烯醇(純度98.0%)、正己醇(純度≥98.0%)、正辛醇(純度99.5%)、芳樟醇(純度98.0%)、正壬醇(純度98.0%)、4-松油烯醇(純度98.0%)、α-松油醇(純度98.0%)、香茅醇(純度98.0%)、橙花醇(純度97.0%)、香葉醇(純度97.0%)、紫蘇醇(純度90.0%)、辛酸甲酯(純度>99.0%)、丁酸己酯(純度>98.0%)、乙酸橙花酯(純度95.0%)、乙酸香葉酯(純度95.0%)、己酸己酯(純度>98.0%)、鄰苯二甲酸二乙酯(純度≥99.5%)、己醛(純度97.0%)、反式-2-己烯醛(純度98.0%)、2,4-己二烯醛(純度>95.0%)、苯甲醛(純度≥98.0%)、正辛醛(純度≥99.0%)、正壬醛(純度96.0%)、香茅醛(純度96.0%)、正十一醛(純度97.0%)、月桂醛(純度95.0%),阿拉丁試劑(上海)有限公司;β-丁香烯(純度≥98.0%)、反式-β-金合歡烯(純度≥98.0%)、香芹酮(純度≥95.0%)、醋酸辛酯(純度≥98.0%)、反,反-2,4-癸二烯醛(純度>90.0%),上海源葉生物科技有限公司;順式-β-金合歡烯(純度>98.0%)、大牛兒烯D(純度99.3%)、β-芹子烯(純度90.0%)、α-布藜烯(純度90.0%),加拿大TRC公司;檜烯(純度75.0%)、檸檬烯氧化物(純度≥95.0%),美國(guó)Sigma-Aldrich公司;丁香酚(純度99.0%),上海Macklin生物化學(xué)有限公司;辛酸己酯(純度≥99.0%),北京邁瑞達(dá)科技有限公司;α-金合歡烯(純度>99.9%),東京化成工業(yè)株式會(huì)社;巴倫西亞橘烯(純度93.4%),美國(guó)Chromadex公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C氣相色譜一單四極桿質(zhì)譜儀,美國(guó)Agilent公司,配Combi PAL自動(dòng)進(jìn)樣器(瑞士CTC公司);HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm id×0.25 μm),美國(guó)Agilent公司;二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/CAR/PDMS 50/30 μm),美國(guó)Supelco公司;Milli-Q Advantage A10超純水器,美國(guó)Millipore公司;XS205電子天平(感量0.01 mg)、PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g),瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氣相條件

采取程序升溫,35 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min,再以5 ℃/min升至250 ℃,保持2 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣;載氣為高純氦氣(純度均≥99.999%),1 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化方式是EI,電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍m/z35～450。

1.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取50種標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg于10 mL棕色容量瓶中,用丙酮定容,搖勻,配制成500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)母液,轉(zhuǎn)移到帶蓋棕色試劑瓶中,置于-50 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3.4 HS-SPME條件

稱取3.00 g樣品,置20 mL螺口樣品瓶中,加入3.00 mL飽和NaCl溶液和2.00 μL環(huán)己酮(內(nèi)標(biāo)物),用聚四氟乙烯隔墊密封,在50 ℃孵化器中加熱平衡20 min。用萃取頭頂空吸附50 min后,將萃取頭插入GC進(jìn)樣,解析5 min。每份樣品各3個(gè)平行。

1.4 定性和半定量分析

利用Flavour 2.0和NIST 08質(zhì)譜庫(kù),篩選出匹配度≥90%的物質(zhì),同時(shí)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間進(jìn)行定性。在1.3.1節(jié)中相同的程序升溫條件下,獲得C5～C25正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間,結(jié)合各成分的保留時(shí)間,按照公式(1)計(jì)算樣品中各成分的保留指數(shù)(retention index,RI)。

RI=100×Z+100×(tx-tz)/(t(z+1)-tz)

(1)

式中:Z和Z+1分別為目標(biāo)化合物(X)流出前后的正構(gòu)烷烴所含碳原子的數(shù)目;tx、tz、t(z+1)分別為目標(biāo)物及碳數(shù)為Z,Z+1正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間,且有tz

用內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行半定量,半定量按公式(2)計(jì)算:

RC=Ax×m環(huán)己酮/(A環(huán)己酮×m樣品)

(2)

式中:RC,目標(biāo)物的相對(duì)含量;Ax和A環(huán)己酮分別為目標(biāo)物和環(huán)己酮的峰面積;m環(huán)己酮和m樣品分別為環(huán)己酮和樣品的質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將得到的以樣品編號(hào)、揮發(fā)性成分名稱以及50種揮發(fā)性成分半定量數(shù)據(jù)的原始數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件(Umetrics,瑞典)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先利用PCA對(duì)不同產(chǎn)地48個(gè)樣品分布進(jìn)行整體解釋,再采用OPLS-DA對(duì)PCA結(jié)果進(jìn)行分組并建模。最后根據(jù)建模篩選出的成分進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),根據(jù)顯著性分析,篩選潛在生物標(biāo)志物。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性和半定量分析

根據(jù)HS-SPME-GC-MS檢測(cè)結(jié)果,檢索圖譜庫(kù)(Flavour 2.0和NIST 08)篩選匹配度≥90%的物質(zhì),同時(shí)結(jié)合標(biāo)品保留時(shí)間進(jìn)行定性,在重慶、四川、廣西、云南沃柑果皮中累計(jì)檢測(cè)出萜烯類、醇類、酮類、酯類、醛類和其他類50種物質(zhì),其中萜烯類18種、醇類11種、醛類10種、酯類8種、酮類1種、其他類2種,具體見(jiàn)表2。

表2 沃柑果皮揮發(fā)性成分定性結(jié)果Table 2 Qualitative results of volatile components in the peel of Orah mandarin

續(xù)表2

半定量結(jié)果見(jiàn)表3所示。4個(gè)產(chǎn)地沃柑之間揮發(fā)性物質(zhì)組成和含量均有差異。檸檬烯是主要的揮發(fā)性物質(zhì),月桂烯、α-蒎烯、芳樟醇、正辛醇、正辛醛、香茅醇、己醛、反式-2-己烯醛、檜烯、香芹酮和α-松油醇等次之。其中,峰面積占比,檸檬烯平均為89.06%,月桂烯、α-蒎烯、芳樟醇、正辛醇、正辛醛、香茅醇、己醛、反式-2-己烯醛、檜烯、香芹酮和α-松油醇分別為4.03%、0.98%、0.92%、0.73%、0.68%、0.38%、0.34%、0.32%、0.30%、0.26%和0.23%,這與文獻(xiàn)基本吻合[19-21]。

表3 沃柑果皮揮發(fā)性成分半定量結(jié)果Table 3 Semiquantitative results of volatile components in the peel of Orah mandarin

續(xù)表3

2.2 模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

將4個(gè)產(chǎn)地48個(gè)樣品的50種揮發(fā)性成分半定量結(jié)果組成的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14.1。為了查看樣品大致分布情況,首先進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的PCA(圖1)。

圖1 不同產(chǎn)地沃柑揮發(fā)性成分非監(jiān)督PCA模型Fig.1 The unsupervised PCA model of Orah mandarin in different origins

非監(jiān)督PCA模型中,第1主成分解釋了20%,第2主成分解釋了10.7%,可見(jiàn)總的方差解釋率不高。四川和重慶,能夠較為明顯的區(qū)分開(kāi),只有小部分相交,但云南和廣西不能明顯區(qū)分,源于兩地的地理、氣候環(huán)境相差不大。因此,分別對(duì)四川和重慶、云南和廣西采用有監(jiān)督的OPLS-DA分析,可以剔除樣本中的無(wú)關(guān)因素,使組間的差異最大化,以找到不同產(chǎn)地間的潛在標(biāo)志物。四川和重慶的OPLS-DA模型見(jiàn)圖2。如圖2-a所示,四川和重慶的沃柑在OPLS-DA模型上被完全區(qū)分開(kāi),模型能夠解釋X方向95%的信息(R2X=0.95),Y方向98.6%(R2Y=0.986),由Q2=0.953得知,四川和重慶模型的預(yù)測(cè)能力為95.3%,大于0.5,所建模型良好。為驗(yàn)證模型是否過(guò)擬合,設(shè)置假設(shè)檢驗(yàn)的次數(shù)為200,檢驗(yàn)結(jié)果如圖2-b所示,其中R2代表模型能夠解釋Y矩陣的信息,Q2代表通過(guò)交叉驗(yàn)證計(jì)算得到的模型的預(yù)測(cè)能力,最右邊值為真實(shí)值,左邊值為模擬得到的值。所有R2和Q2的左邊點(diǎn)都低于最右邊點(diǎn),代表其檢測(cè)值都低于真實(shí)值,Q2的回歸線截距為-1.16,小于0.5,且R2和Q2的回歸線的斜率大于1,證明此模型沒(méi)有過(guò)擬合。

a-SC、CQ;b-R2、Q2

如圖3-a所示,廣西和云南的沃柑在OPLS-DA模型上能夠被完全區(qū)分開(kāi),模型能夠解釋X方向98.5%的信息(R2X=0.985),Y方向95.7%(R2Y=0.957),由Q2=0.745得知,廣西和云南模型的預(yù)測(cè)能力為74.5%,大于0.5,所建模型良好。同樣,為驗(yàn)證模型是否過(guò)擬合,設(shè)置假設(shè)檢驗(yàn)的次數(shù)為200,如圖3-b所示:所有R2和Q2的檢測(cè)值都低于真實(shí)值,Q2的回歸線截距為-1.23,小于0.5,且R2和Q2的回歸線的斜率大于1,也證明此模型沒(méi)有過(guò)擬合。

a-GX、YN;b-R2、Q2

2.3 潛在生物標(biāo)志物篩選

s-plot圖代表變量在模型的貢獻(xiàn)大小。s-plot圖中,位于兩端的變量在模型的貢獻(xiàn)率較大,可能為所尋找的生物標(biāo)志物。此外,VIP值可以評(píng)價(jià)變量的貢獻(xiàn)大小,通常選用VIP>1的變量。利用SIMCA-P 14.1軟件,可以得到2個(gè)模型的VIP預(yù)測(cè)值。四川和重慶兩地,VIP>1的有檸檬烯、芳樟醇、月桂烯、香茅醇。廣西和云南兩地,VIP>1的有檸檬烯、醋酸辛酯和α-松油醇,因此,可以分別篩選出4個(gè)變量和3個(gè)變量,結(jié)果如圖4所示。

a-四川和重慶;b-廣西和云南

再根據(jù)SPSS獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),篩選出P<0.05的標(biāo)記物,結(jié)果如表4和表5所示。

表4 四川、重慶沃柑潛在生物標(biāo)志物Table 4 Potential biomarkers of Orah mandarin in Sichuan and Chongqing

表5 廣西、云南沃柑潛在生物標(biāo)志物Table 5 Potential biomarkers of Orah mandarin in Guangxi and Yunnan

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)四川、重慶、云南和廣西4個(gè)主產(chǎn)地沃柑果皮中揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定,4個(gè)產(chǎn)地沃柑之間揮發(fā)性成分組成和含量均有差異,其中萜烯類物質(zhì)最為豐富,其次為醇類、醛類、酯類和酮類等?；趽]發(fā)性成分半定量結(jié)果,結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,建立了四川和重慶、云南和廣西沃柑的2個(gè)OPLS-DA模型,篩選出的潛在生物標(biāo)志物分別較好地區(qū)分了四川和重慶、云南和廣西沃柑。本文的沃柑產(chǎn)地判別模型,只利用了譜庫(kù)和現(xiàn)有標(biāo)品鑒定的數(shù)據(jù),會(huì)造成部分成分缺失,可能會(huì)影響潛在生物標(biāo)志物的確定,因此可以進(jìn)行非靶向篩查。沃柑果皮中所含揮發(fā)性成分繁多,除產(chǎn)地外,還有樹(shù)齡、栽培方式、管理模式等影響因素,未來(lái)應(yīng)加大樣本量、擴(kuò)大揮發(fā)性成分范圍,為產(chǎn)地溯源構(gòu)建更加精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)模型。此外,后續(xù)也可以結(jié)合氣相色譜-嗅辨儀和感官評(píng)定來(lái)進(jìn)一步研究分析不同產(chǎn)地沃柑揮發(fā)性成分的差異。