王曉娜,田開仁,吳昊,寇佳祥,喬建軍,,李艷妮*

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院,天津,300072)2(系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300072) 3(天津大學(xué) 浙江研究院(紹興),浙江 紹興,312300)

自1780年瑞典化學(xué)家舍勒從酸奶中分離得到乳酸以來,乳酸作為一種酸味劑、增味劑和防腐劑,在食品、制藥、化妝品和其他化學(xué)工業(yè)中占據(jù)了重要地位。近年來,乳酸作為生產(chǎn)聚乳酸的原料而備受關(guān)注。聚乳酸作為一種可生物降解的聚合物,可替代石油基塑料用于包裝和醫(yī)療領(lǐng)域。此外,光學(xué)純L-乳酸或/和D-乳酸聚合成的聚乳酸具有更好的熱穩(wěn)定性和機(jī)械性,有望在未來應(yīng)用于汽車和電子領(lǐng)域[1]。乳酸的市場需求每年以10%的速度增長,且2022年全球乳酸產(chǎn)能已達(dá)到99.5萬t。因此,具有高光學(xué)純度和低發(fā)酵成本等優(yōu)勢的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸受到廣泛關(guān)注。

為了構(gòu)建具有高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)率的高效乳酸合成微生物細(xì)胞工廠,研究人員開發(fā)了多種代謝工程策略,包括乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的表達(dá)調(diào)控、糖酵解途徑優(yōu)化、副產(chǎn)物途徑的阻斷、氧化還原平衡調(diào)節(jié)等。與此同時,通過拓寬微生物細(xì)胞工廠中可利用的碳源種類降低乳酸發(fā)酵成本,提高菌株工業(yè)魯棒性,為放大發(fā)酵奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外,在基因編輯、多基因同時調(diào)控、基因動態(tài)調(diào)控、高通量篩選等新技術(shù)的輔助下,乳酸合成微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建得到了顯著加速。在這個過程中,不同菌種在乳酸生產(chǎn)方面具有不同的優(yōu)勢和生產(chǎn)能力。表1為不同菌種高產(chǎn)乳酸的研究現(xiàn)狀總結(jié)。

表1 不同菌種的乳酸生產(chǎn)能力研究現(xiàn)狀Table 1 Research status of lactic acid production capacity of different strains

本文總結(jié)了近年來利用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠合成乳酸的研究進(jìn)展,并對當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)及未來的研究方向進(jìn)行了探討。

1 代謝通路的構(gòu)建與優(yōu)化

要構(gòu)建高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)率的乳酸合成微生物細(xì)胞工廠,乳酸代謝通路的構(gòu)建與優(yōu)化是不可或缺的。LDH的表達(dá)調(diào)控、糖酵解途徑的強(qiáng)化以及副產(chǎn)物代謝途徑的敲除,可為乳酸的形成提供更多代謝通量;阻斷L-乳酸或D-乳酸對映體的生成,實(shí)現(xiàn)了高光學(xué)純度乳酸的生產(chǎn)。此外,新興的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型(genome-scale metabolic model, GSMM)從全局水平指導(dǎo)乳酸生產(chǎn)菌株的改造,為乳酸產(chǎn)量的提高提供了新的思路(圖1)。

1.1 LDH的表達(dá)調(diào)控

LDH催化丙酮酸生成乳酸是微生物合成乳酸的關(guān)鍵步驟。在天然乳酸生產(chǎn)菌中,可使用強(qiáng)啟動子取代LDH的啟動子和增加基因拷貝數(shù)來提高乳酸產(chǎn)量[13]。而對于非天然乳酸生產(chǎn)菌株或合成量較少的菌株,需篩選高酶活力的LDH來構(gòu)建異源代謝通路。目前未見研究來系統(tǒng)評估來源不同的LDH催化活性及同一個LDH在不同的宿主存在活性差異,研究人員仍需檢測多個不同來源的LDH來挑選具有較高活性的酶,不同微生物細(xì)胞工廠使用的LDH來源如表2所示。隨著合成生物學(xué)工具和策略的發(fā)展,一些基因表達(dá)元件或方法可以用于提高LDH的表達(dá)水平和催化效率。ZHOU等[14]通過啟動子工程策略,調(diào)整ldhA上游的潛在轉(zhuǎn)錄區(qū)域來微調(diào)基因表達(dá),實(shí)現(xiàn)了菌株生長速率和乳酸產(chǎn)量的同時提高。田康明等[15]使用溫度誘導(dǎo)型啟動子PR-PL作為遺傳開關(guān)來調(diào)控E.coli中乳酸的合成。前期低溫發(fā)酵以保證高細(xì)胞密度,后期高溫發(fā)酵則誘導(dǎo)LDH表達(dá)。與之類似,HWANG等[16]利用Pnar啟動子將E.coli發(fā)酵過程分為高氧誘導(dǎo)生長階段和低氧誘導(dǎo)乳酸合成,這兩種LDH的動態(tài)調(diào)控方法均能有效提高乳酸產(chǎn)量(圖1-a)。此外,REIDER APEL等[17]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了一個無克隆的工具包,可以用于S.cerevisiae中LDH的整合位點(diǎn)和啟動子的選擇。目前單純通過LDH的表達(dá)調(diào)控尚不能達(dá)到乳酸工業(yè)化生產(chǎn)的要求,還需進(jìn)行其他代謝工程改造。

a-LDH的表達(dá)調(diào)控;b-糖酵解途徑的強(qiáng)化;c-副產(chǎn)物途徑的敲除;d-乳酸光學(xué)純度的提升;e-GSMM指導(dǎo)菌株改造[12]

表2 不同宿主中異源表達(dá)LDH的來源Table 2 Source of heterologously expressed LDH in different hosts

1.2 糖酵解途徑的強(qiáng)化

乳酸的合成前體是丙酮酸,而丙酮酸是糖酵解的終產(chǎn)物。因此,為了實(shí)現(xiàn)高效的乳酸生產(chǎn),需要加強(qiáng)糖酵解途徑(圖1-b)。磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PYK)是糖酵解的限速酶[18]。在E.coliKO20中,通過pfk和異源pyk基因的過表達(dá)可使乳酸產(chǎn)量增加9倍[19]。在C.glutamicumCRZ2中,過表達(dá)pfk基因乳酸產(chǎn)量僅能提高15%,過表達(dá)pyk則會導(dǎo)致產(chǎn)量下降,而過表達(dá)負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖激酶基因glk,乳酸產(chǎn)量提高了98%[20]。酵母中pfk和pyk基因的過表達(dá)雖能增加酶的表達(dá),但葡萄糖的消耗率仍保持不變。因此,YAMADA等[18]通過全局代謝工程技術(shù)將不同啟動子的13種糖酵解相關(guān)基因隨機(jī)整合到酵母基因組中的δ位點(diǎn),顯著提高葡萄糖消耗率,并在后續(xù)研究中將這種方法應(yīng)用于乳酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建[21]?？傊?強(qiáng)化糖酵解途徑來提升乳酸的產(chǎn)量的瓶頸可能并非由單一酶引起,且不同菌株中糖酵解相關(guān)基因的過表達(dá)對乳酸合成的影響也不同。因此,需要從糖酵解途徑的全局出發(fā),系統(tǒng)地提高葡萄糖消耗率,進(jìn)而提升乳酸的產(chǎn)量。

1.3 副產(chǎn)物途徑的敲除

乳酸發(fā)酵包括同型乳酸發(fā)酵、異型乳酸發(fā)酵以及混合酸發(fā)酵,其中同型乳酸發(fā)酵只產(chǎn)生乳酸,無副產(chǎn)物途徑,理論產(chǎn)率可達(dá)100%。而在異型乳酸發(fā)酵或混合酸發(fā)酵過程中,阻斷或減少副產(chǎn)物合成路徑能使更多的碳通量流向乳酸合成。異型乳酸發(fā)酵會產(chǎn)生乙醇、乙酸和CO2等副產(chǎn)物(圖1-c),阻斷磷酸戊糖酮解酶途徑,將碳通量重新定向到磷酸戊糖途徑,可以減少副產(chǎn)物的形成,提高乳酸產(chǎn)量。在混合酸發(fā)酵時,阻斷丙酮酸代謝旁路可提高乳酸產(chǎn)量(圖1-c)。在大腸桿菌中,丙酮酸甲酸裂解酶PFLB、乙酸激酶ACKA和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶PTA是丙酮酸代謝中影響乳酸產(chǎn)量的關(guān)鍵酶,對E.coliMG1655分別單基因缺失后乳酸產(chǎn)量可增加39.6%、25.2%和39.4%[22]。對于酵母而言,乙醇是丙酮酸代謝的主要產(chǎn)物。失活丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adh可減少乙醇積累,增加乳酸積累量[23],阻止二羥丙酮磷酸合成甘油可將碳通量引向乳酸合成途徑,進(jìn)一步提高乳酸產(chǎn)量。除大腸桿菌和酵母外,不同生產(chǎn)菌株還需阻斷其他副產(chǎn)物代謝途徑,如Kluyveromycespneumoniae需在失活丙酮酸代謝關(guān)鍵基因的基礎(chǔ)上再失活2,3-丁二醇合成途徑[24]。

1.4 乳酸光學(xué)純度的提升

光學(xué)純L-乳酸或/和D-乳酸能夠合成高結(jié)晶度和高熔點(diǎn)的聚乳酸,從而用于生產(chǎn)纖維、薄膜和液晶,具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。因此,提高乳酸的光學(xué)純度對聚乳酸的應(yīng)用至關(guān)重要。乳酸的光學(xué)純度受宿主選擇和底物復(fù)雜性的影響(圖1-d)。野生型乳酸生產(chǎn)菌株通常同時產(chǎn)生L-乳酸和D-乳酸。為了提高D-乳酸的光學(xué)純度,失活L-LDH是最常用的方法[25]。由于菌株通常含有多個L-LDH,給實(shí)際操作帶來困難,近期發(fā)表的CRISPR胞脫氨酶輔助堿基編輯器可以同時失活L.lactisNZ9000中的4個L-LDH,為乳酸菌的乳酸光學(xué)純度提升提供了新技術(shù)[26]。當(dāng)存在乳酸外消旋酶基因larA時,還需敲除larA[25]。此外,甲基乙二醛旁路會同時產(chǎn)生L-乳酸和D-乳酸,通過失活甲基乙二醛合成酶基因mgsA,也可以提高D-乳酸光學(xué)純度[27]。最后,當(dāng)過表達(dá)L-乳酸氧化酶基因loxL時,可以消耗L-乳酸,從而在被L-乳酸污染的復(fù)雜培養(yǎng)基中也能實(shí)現(xiàn)高光學(xué)純D-乳酸的發(fā)酵[28]。提高L-乳酸純度時,以上策略也適用?？傊?由于菌株的特異性和培養(yǎng)基的不同,通常采用多種策略聯(lián)合使用,以滿足聚合級乳酸的要求。

1.5 基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)菌株改造

基于基因組測序分析構(gòu)建的GSMM,通過對微生物基因、蛋白以及代謝反應(yīng)之間的關(guān)系進(jìn)行表征,來預(yù)測模擬不同系統(tǒng)水平的代謝反應(yīng)通量,為解析復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制、高效定向改造微生物奠定了基礎(chǔ)(圖1-e)。GSMM已廣泛用于預(yù)測細(xì)胞表型、指導(dǎo)代謝工程、預(yù)測藥物靶點(diǎn)、檢測生物標(biāo)志物等方面[29]。

目前,基于GSMM的代謝工程改造已經(jīng)在酵母和大腸桿菌中得到了應(yīng)用。2000年,報道了首個大腸桿菌GSMM—iJE660[30]。2003年,基于iJE660首次使用OptKnock算法對大腸桿菌高產(chǎn)乳酸的基因敲除靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,ack、pta、pfk、fba、adhE以及glk基因的聯(lián)合缺失可得到18.13 mmol/h的最佳乳酸生產(chǎn)率[31]。隨著GSMM的改進(jìn)和算法的更新,研究人員陸續(xù)探索了ABCMOMA、BATMOMA以及CSMMOMA等混合算法,用于預(yù)測乳酸產(chǎn)率的最優(yōu)解。然而,以上的設(shè)計(jì)基因敲除策略需要其他基因的上調(diào)或下調(diào)以匹配所需的通量分布,因此又提出了一種基于約束的算法GeneReg[32]。經(jīng)該算法預(yù)測,酵母需要至少36個基因的上調(diào)或下調(diào),以實(shí)現(xiàn)酵母中乳酸的高效生產(chǎn),最大乳酸合成通量為56.66 mmol/(g DW·h)。GSMM全面和系統(tǒng)化的代謝網(wǎng)絡(luò)分析,為乳酸提供了更加經(jīng)濟(jì)和可持續(xù)的生產(chǎn)方式。隨著各種微生物GSMM的構(gòu)建和完善,GSMM將用于多種乳酸菌、谷氨酸棒桿菌等微生物的代謝工程,以實(shí)現(xiàn)乳酸的高效生產(chǎn)。但目前預(yù)測精度仍不高,需要進(jìn)行“濕實(shí)驗(yàn)”來驗(yàn)證預(yù)測,并很少獲得成功的應(yīng)用。

2 氧化還原平衡的調(diào)節(jié)

細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)是由多個氧化還原反應(yīng)組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)維持的。當(dāng)涉及氧化還原反應(yīng)的代謝途徑發(fā)生改變或引入新代謝途徑時,往往會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化還原失衡,從而降低工業(yè)微生物的生長性能和產(chǎn)物合成能力[33]。因此,調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)是提高乳酸產(chǎn)量的有效途徑之一。

通過在培養(yǎng)基中添加甘油、山梨醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽以及Na2S等化合物,降低底物的氧化還原電位,并提供更多的還原當(dāng)量,從而顯著提高乳酸的生產(chǎn)率[34]。此外,NADH/NAD+和NADPH/NADP+等氧化還原輔因子在分解代謝、合成代謝以及能量產(chǎn)生的耦合中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。氧化還原輔因子的擾動對產(chǎn)物分布以及細(xì)胞內(nèi)代謝物含量均有顯著的影響。主要還原副產(chǎn)物(如乙醇和甘油)代謝途徑的敲低、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因gapdh的過表達(dá)[35]以及NADH脫氫酶基因nde的失活[36],均可提高胞內(nèi)NADH水平,進(jìn)而提高乳酸產(chǎn)量。此外,通過對大腸桿菌氧化還原相關(guān)反應(yīng)的全基因組分析,發(fā)現(xiàn)D-乳酸的產(chǎn)量還與核苷酸和氨基酸代謝相關(guān)的脫氫酶基因(如guaB、pyrD和serA)有關(guān)。這些基因的單基因缺失可以增加乳酸產(chǎn)量[37]。

除氧化還原相關(guān)酶以外,全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rex可以通過響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比率的變化來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[38]。失活Caldicellmlosiruptorbescii中的rex基因會使細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位降低,從而使乳酸等代謝產(chǎn)物積累增加[39]。但是rex基因的缺失在不同菌株中可能會產(chǎn)生不同的代謝效應(yīng),例如,在Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum中,rex基因的缺失解除了對adhE和adhA的表達(dá)調(diào)控,導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量增加兩倍,而乳酸產(chǎn)量減少[38]。因此,rex基因的缺失的不同代謝效應(yīng)可能取決于其調(diào)控的靶點(diǎn)不同而導(dǎo)致的,因此仍需進(jìn)一步研究?？傊?全面了解不同菌株氧化還原代謝將有助于設(shè)計(jì)氧化還原系統(tǒng)以促進(jìn)乳酸的高效生產(chǎn)。

3 底物譜的拓寬

乳酸發(fā)酵底物成本約占總成本的40%～70%,是影響乳酸生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性的重要因素。為了降低乳酸的發(fā)酵成本,需要拓寬乳酸生產(chǎn)菌株的底物譜,促進(jìn)廉價的農(nóng)業(yè)工業(yè)廢棄物在乳酸發(fā)酵中的應(yīng)用。

碎米、廢木薯渣以及廢姜黃等農(nóng)業(yè)廢棄物中富含淀粉。然而大多數(shù)乳酸菌無法直接利用淀粉類物質(zhì),通常需要對淀粉原料進(jìn)行預(yù)處理或者對菌株進(jìn)行改造。研究者通過表達(dá)α-淀粉酶基因amyA,實(shí)現(xiàn)了利用玉米淀粉和糙米同步糖化發(fā)酵乳酸[25]。此外,木質(zhì)纖維素也廣泛存在于農(nóng)業(yè)廢棄物中,如玉米秸稈、大豆殘?jiān)透收嵩?。該類原料的使用可有效避免食品資源的浪費(fèi),是理想的廉價乳酸發(fā)酵底物。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中木糖占總糖的30%,但大部分乳酸菌缺乏木糖同化的能力,使木質(zhì)纖維素的應(yīng)用受到限制。將來源于Lactobacilluspentosus和LactobacilluslactisIO-1的木糖同化基因引入乳酸菌后,從而使其能夠利用木糖作為碳源進(jìn)行乳酸發(fā)酵[40]。對于纖維素類生物質(zhì),通常需要使用昂貴的纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理。為了解決這一問題,GANDINI等[41]在乳桿菌中整合β-葡萄糖苷酶基因bglA和內(nèi)切葡聚糖酶基因engD,構(gòu)建了纖維素酶系統(tǒng)。該菌株可利用纖維素低聚糖作為底物一步發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,向光學(xué)純?nèi)樗岬牡统杀究沙掷m(xù)生物發(fā)酵邁出了重要一步。

另外,廉價農(nóng)業(yè)工業(yè)廢棄物的水解產(chǎn)物中的碳源大多是混合糖,乳酸生產(chǎn)菌株在混合糖存在的情況下,首先消耗葡萄糖,抑制碳分解代謝,導(dǎo)致糖未能充分利用,從而降低發(fā)酵效率并增加生產(chǎn)成本。為了解決這一問題,LU等[42]對大腸桿菌編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的主要酶IIBCglc中的ptsG基因進(jìn)行失活。ptsG基因缺失導(dǎo)致磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphotransferase system,PTS)系統(tǒng)被破壞,葡萄糖只能依靠半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GalP和Mgl等低效率的替代系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而消除了分解代謝抑制。LI等[43]在阻斷PTS系統(tǒng)和激活Gal系統(tǒng)的同時,將木糖分解的限速酶木糖異構(gòu)酶基因xylA替換為B.coagulans的xylABC。該雙通道工藝使木糖利用率增加46.3%。WANG等[44]通過研究基于阻遏物的木糖傳感/調(diào)控基因線路,開發(fā)了一種高通量篩選方法,成功獲得了木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT14的突變體,其木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高了6.5倍,為提高菌株中木糖的利用率提供了新的解決方案。

以上方法雖然有助于提高底物利用率和乳酸發(fā)酵效率,但當(dāng)?shù)孜飶?fù)雜度增加時,這些方法的適用性會受到限制,仍需要進(jìn)一步的優(yōu)化和改進(jìn),以提高其在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中的可行性和效率。

4 乳酸生產(chǎn)菌株的工業(yè)魯棒性

乳酸工業(yè)生產(chǎn)過程中面臨各種惡劣的工業(yè)條件,包括低pH值、高溫、高糖以及來自廉價生物質(zhì)水解物中的有毒抑制劑等。微生物魯棒性是指面對各種擾動時保持穩(wěn)定和高效表型的能力。通過理性設(shè)計(jì)加定向進(jìn)化可提高菌株對惡劣工業(yè)條件和有毒抑制劑的脅迫耐受性,從而提高乳酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

4.1 菌株酸脅迫耐受性的提高

微生物發(fā)酵過程中乳酸的積累導(dǎo)致pH值逐漸降低,當(dāng)pH值低于乳酸的pKa時,游離乳酸會擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi),由于胞內(nèi)pH值高于乳酸的pKa,游離乳酸會解離成酸性陰離子和質(zhì)子,對細(xì)胞造成損傷[9]。目前解決這一問題的主要方法是添加中和劑[如NaOH、Ca(OH)2、CaCO3和氨水等],但這會增加發(fā)酵成本和下游的分離純化成本。因此,工業(yè)菌株的酸脅迫是目前乳酸工業(yè)生產(chǎn)面臨的主要問題之一。

微生物對酸脅迫的反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程。目前,生物化學(xué)、蛋白組學(xué)和遺傳學(xué)的研究已證實(shí)了酸脅迫耐受性與各種細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)過程密切相關(guān)。菌株對乳酸脅迫的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)很大程度上受轉(zhuǎn)錄因子的影響(圖2-a)。BAEK等[23]在S.cerevisiae中表達(dá)全局轉(zhuǎn)錄因子Haa1可促使其亞細(xì)胞定位由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核,并誘導(dǎo)其靶基因ygp1、gpg1和spi1的表達(dá),從而介導(dǎo)酵母對乳酸的脅迫適應(yīng)[23]。sRNA可以通過與mRNA相互作用快速調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá),在環(huán)境壓力響應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[45](圖2-b)。GAIDA等[46]在E.coli中過表達(dá)3種sRNAs:DsrA、RprA和ArcZ,將乳酸耐受性提高1 270倍。為了減少乳酸在胞內(nèi)的積累,表達(dá)乳酸陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因jen1和ady2,可將陰離子輸送到細(xì)胞外,從而增加S.cerevisiae中乳酸的產(chǎn)量[47](圖2-c)。最后,通過加強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以減少孔隙度和改變質(zhì)膜的脂質(zhì)組成以增加膜剛性來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞包膜重排,也可以增加酸脅迫耐受性[48](圖2-d)。

除了前面提到的方法,低pH值適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化(adaptive laboratory evolution,ALE)被應(yīng)用于平衡細(xì)胞的耐酸能力與乳酸產(chǎn)量。在ALE獲得目標(biāo)菌株后,通過系統(tǒng)生物學(xué)分析闡明有助于酸耐受的遺傳機(jī)制或遺傳靶標(biāo),并進(jìn)行反向代謝工程將有益突變重新引入野生型或其他工程菌株,能進(jìn)一步提高菌株耐酸能力和乳酸產(chǎn)量(圖2-e)。此外,基于隨機(jī)突變的基因組進(jìn)化和可示蹤基因組進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于提高酸耐受性(圖2-f)。SI等[49]開發(fā)了一種自動化多重基因組進(jìn)化方法,通過結(jié)合RNA干擾和CRISPR/Cas9技術(shù),進(jìn)行多輪迭代基因組進(jìn)化提高S.cerevisiae乙酸耐受性,將來也可用于提高菌株對其他酸的耐受能力。

a-應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或敲除;b-sRNA調(diào)控基因表達(dá);c-加強(qiáng)乳酸陰離子外排;d-增加細(xì)胞壁厚度; e-適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化;f-基因組進(jìn)化

4.2 菌株熱脅迫耐受性的提高

在工業(yè)發(fā)酵過程中,微生物的生長代謝和發(fā)酵罐的攪拌會產(chǎn)生大量熱能。當(dāng)發(fā)酵溫度高于某一區(qū)間時,菌株會由于新陳代謝速率加快而引起早衰,嚴(yán)重影響乳酸的產(chǎn)率。然而,采用高溫發(fā)酵可減少副產(chǎn)物的生成、降低噬菌體污染的風(fēng)險,同時還能降低滅菌成本和冷卻費(fèi)用。從自然界分離的嗜熱芽孢桿菌可以在50 ℃時進(jìn)行乳酸的開放發(fā)酵。除此之外,大部分乳酸生產(chǎn)菌株都是嗜溫菌。與嗜熱菌相比,嗜溫菌在分批發(fā)酵過程通常具有更好的乳酸生產(chǎn)能力,因此研究其熱應(yīng)激反應(yīng)的分子基礎(chǔ),特別是熱休克蛋白的作用及其調(diào)控機(jī)制,對提高菌株的熱脅迫耐受性具有重要指導(dǎo)意義。當(dāng)細(xì)胞暴露于高溫環(huán)境中時,DnaK-GrpE-DnaJ和GroES-GroEL伴侶復(fù)合物對細(xì)胞膜的穩(wěn)定和DNA復(fù)制等生物學(xué)過程具有重要作用。在L.lactis中過表達(dá)熱休克蛋白GroES和DnaK,可以引導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊,從而提高乳酸乳球菌的熱脅迫耐受性并得到較高的乳酸生產(chǎn)率[51]。最近,LI等[52]利用CRISPR基因激活文庫篩選技術(shù),成功應(yīng)用于提升K.marxianus的熱脅迫耐受性,并闡明了一種新的耐高溫機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)脂肪酸合成代謝通路的關(guān)鍵基因OLE1可以提高不飽和脂肪酸比例,降低胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平,從而有效提升酵母的熱脅迫耐受性。

4.3 菌株抑制劑耐受性的提高

復(fù)雜的木質(zhì)纖維素在預(yù)處理過程中會產(chǎn)生抑制劑,如呋喃、酚類化合物、生物醇、無機(jī)離子和脂肪酸等。這些化合物能夠抑制酶的活性和細(xì)胞生長,從而影響乳酸發(fā)酵過程。通過生物脫毒可去除一部分抑制劑,但為了減少糖類在脫毒過程中的消耗,仍會殘留少量抑制劑。研究表明,L-1,2-丙二醇氧化還原酶FucO可催化糠醛還原為毒性較小的醇,因此可以通過表達(dá)天然fucO基因來提高菌株的糠醛耐受性。之后通過引入FucO同源二聚體界面L7F突變,可將酶活力提高10倍,同時糠醛代謝速率增加了一倍[53]。除此之外, LIAN等[54]將可同時進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄抑制和基因敲除的三功能CRISPR體系與寡核苷酸芯片技術(shù)結(jié)合,成功開發(fā)出多功能全基因組進(jìn)化技術(shù),經(jīng)過3輪進(jìn)化,酵母能夠在17.5 mmol/L糠醛濃度下消耗大部分的葡萄糖。此外,篩選到多個糠醛耐受性相關(guān)的新靶點(diǎn),如SLX5、NUP133和GPI17等。盡管該技術(shù)目前用于乙醇發(fā)酵,但未來有望將其應(yīng)用于乳酸發(fā)酵生產(chǎn)。通過短鏈脫氫酶CGS9114_RS09725的整合可提高P.acidilactici對香草醛的耐受性[55]。表達(dá)氧化還原酶基因ZMO1116可提高菌株對苯醌的耐受性[56]。然而,以上研究只針對單一抑制劑,在面對復(fù)雜的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的混合抑制劑時,其耐受性仍然不足。為此,有研究報道,在未脫毒的玉米芯水解液中經(jīng)過111 d的長期ALE,可同時提高多種醛抑制劑的生物轉(zhuǎn)化能力,從而實(shí)現(xiàn)酸預(yù)處理玉米芯水解液一鍋法生產(chǎn)D-乳酸[57]。

4.4 菌株滲透脅迫耐受性的提高

微生物發(fā)酵過程中,高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓產(chǎn)生差異,特別是當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)初始糖濃度過高時,會導(dǎo)致菌株生長延遲,從而影響乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率。雖然補(bǔ)料分批發(fā)酵可以降低初始糖濃度,但提高菌株的滲透脅迫耐受性可以簡化工藝,降低成本。添加滲透保護(hù)劑(如甜菜堿和脯氨酸)是提高滲透脅迫耐受性最簡單的方法[58]。此外,通過在高濃度的甜菜糖蜜中對菌株進(jìn)行ALE,能夠使菌株的糖耐受性和抗氧化能力增強(qiáng),最終使乳酸生產(chǎn)率提高31%[58]。QI等[59]通過對葡萄糖脅迫下L.lactis的代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)進(jìn)行分析,構(gòu)建了葡萄糖脅迫反應(yīng)機(jī)制模型,發(fā)現(xiàn)L.lactis通過上調(diào)氧化還原酶活性來響應(yīng)葡萄糖脅迫,從而提高葡萄糖到乳酸的代謝通量,為提高乳酸生產(chǎn)菌株的滲透脅迫耐受性提供了新思路。

5 結(jié)論與展望

隨著市場對乳酸的需求不斷增加,亟需開發(fā)滿足工業(yè)要求的高性能乳酸生產(chǎn)菌株。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn),研究人員采用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)對菌株進(jìn)行改造,有效提高乳酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率、生產(chǎn)率以及光學(xué)純度。此外,為應(yīng)對工業(yè)發(fā)酵中的極端環(huán)境,理性設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化相結(jié)合的耐受性工程已被用來提高菌株魯棒性。盡管如此,微生物細(xì)胞工廠高效合成乳酸仍存在一定挑戰(zhàn),以下問題還有待進(jìn)一步優(yōu)化:

1)工業(yè)菌株性能的提升往往是通過生物量和目標(biāo)產(chǎn)物的形成、氧化還原平衡和復(fù)雜的耐受調(diào)控之間的權(quán)衡來實(shí)現(xiàn)的。盡管GSMM為系統(tǒng)研究菌株代謝網(wǎng)絡(luò)提供了有利幫助,但仍缺乏轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息。而全細(xì)胞模型能將細(xì)胞內(nèi)所有生命活動模塊化(圖1-e),有望解決目前代謝工程存在的問題并在未來得以應(yīng)用。2)大多數(shù)基因工程乳酸生產(chǎn)菌株在發(fā)酵廉價生物質(zhì)時仍存在困難。因此,需進(jìn)一步開發(fā)可利用廉價替代底物發(fā)酵的菌株以及低毒預(yù)處理技術(shù)。3)由于菌株中涉及的耐受機(jī)制大多是未知的,因此,增強(qiáng)菌株耐受性主要依賴于進(jìn)化工程。對進(jìn)化耐受菌株的耐受遺傳機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)分析,將有助于加快機(jī)制的解析并通過反向代謝工程應(yīng)用于菌株改造。4)新型基因組進(jìn)化技術(shù)為提高乳酸產(chǎn)量提供了新思路,但如何快速對龐大的突變庫進(jìn)行篩選是目前面臨的另一個問題。未來可以結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)和液滴微流控分選技術(shù),以大幅提高基因組進(jìn)化的效率。5)發(fā)酵過程中乳酸濃度和pH值對發(fā)酵至關(guān)重要,但目前還沒有準(zhǔn)確的實(shí)時監(jiān)測工具。最近,XIAO等[60]成功研發(fā)了基于轉(zhuǎn)錄因子LldR的生物傳感器BLac-6,可以同時監(jiān)測Klebsillaoxytoca發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳酸的濃度,這為未來工業(yè)發(fā)酵過程中的乳酸濃度實(shí)時監(jiān)測帶來了希望。