王金磊，李承德，孫宏偉，毛淑梅， 張曉俊， 曲梅花

(濰坊醫(yī)學院 1.藥理學教研室、山東省重點應用藥理學實驗室， 2. 應用心理學教研室，山東 濰坊　261053)

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黃芪多糖抑制NF-κB/MAPK信號通路和改善哮喘大鼠氣道炎癥的作用

王金磊1，李承德1，孫宏偉2，毛淑梅1， 張曉俊1， 曲梅花1

(濰坊醫(yī)學院 1.藥理學教研室、山東省重點應用藥理學實驗室， 2. 應用心理學教研室，山東 濰坊261053)

摘要:目的觀察黃芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)對哮喘大鼠氣道炎癥及NF-κB/MAPK信號通路的影響。方法采用卵蛋白(ovalbumin，OVA)致敏法制備哮喘模型并予以藥物治療。觀察支氣管灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細胞分類計數(shù)、肺組織病理變化、肺泡Ⅰ型上皮超微結構變化；測定肺組織NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65 (p-NF-κB p65)、磷酸化IκBα(p-IκBα)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13含量的變化。結果與正常組比較，OVA致敏明顯升高哮喘組炎癥細胞數(shù)量、增強NF-κB/MAPK信號通路活性。APS可改善哮喘大鼠氣道炎癥、肺Ⅰ型上皮損傷，并明顯抑制NF-κB/MAPK信號通路活性。結論APS改善哮喘大鼠氣道炎癥、細胞損傷的機制可能與抑制NF-κB/MAPK信號通路有關。

關鍵詞：黃芪多糖；哮喘；炎癥；NF-κB/MAPK信號通路；療效；機制

支氣管哮喘是一種炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重影響人類健康[1-2]。NF-κB/MAPK信號通路可介導炎癥反應，在哮喘發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。目前治療哮喘以激素等為主，久用不良反應較大。中醫(yī)中藥在哮喘防治方面積累了大量經驗，黃芪作為一種具備免疫調節(jié)功能的藥物，在哮喘的防治上發(fā)揮著重要作用。黃芪提取物黃芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)在多種疾病的動物模型中顯示了良好的抗炎作用[5]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，APS可抑制支氣管哮喘大鼠氣道炎癥并調節(jié)Th17/Treg 細胞因子表達[6]。但是，APS治療哮喘的機制是否與調節(jié)NF-κB/MAPK信號通路有關未見報道，本研究擬就上述問題進行探索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.2藥品試劑與儀器卵蛋白(ovalbumin，OVA)購于美國Sigma公司，氫氧化鋁購于淄博化學試劑公司，NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13酶聯(lián)免疫試劑盒購于美國Cell Signaling公司、R&D公司、武漢華美公司及上海邦奕公司。霧化泵(德國PARI公司)，H-7500 型透射電子顯微鏡(日立公司) 。

1.2方法

1.2.1模型制備哮喘組、APS組大鼠于分組后第1天(d 1)，腹腔注射致敏液混懸劑2 mL(含有OVA 100mg，氫氧化鋁200 mg)，于d 8第2次注射致敏液。從d 15起，大鼠接受連續(xù)28 d的1% OVA霧化吸入(20 min，40 mL)，每日1次。正常組僅腹腔注射及霧化吸入生理鹽水。

1.2.2藥物治療從d 1 開始，大鼠接受連續(xù)6周的藥物干預。APS組予以腹腔注射APS 400 mg·kg-1·d-1(多項動物實驗顯示，該劑量在大鼠體內可發(fā)揮多種藥理學效應[7]，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，該劑量在大鼠體內具有免疫調節(jié)、抗炎等作用[6])，正常組及哮喘組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.2.3HE染色治療結束處死大鼠，取右肺組織，10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，進行HE染色，光鏡分析病理變化。

1.2.4電鏡處死大鼠后，迅速取1 mm3大小的肺組織置于2.5%戊二醛前固定，繼以1%鋨酸后固定，脫水環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片(1 μm)鈾鉛染色，電鏡觀察肺泡Ⅰ型上皮超微結構。

1.2.5肺泡灌洗液炎癥細胞計數(shù)左側肺臟以生理鹽水(37 ℃)灌洗，收集灌洗液，2 500 r · min-1離心10 min?；厥占毎M行瑞氏染色，光鏡下分類計數(shù)炎癥細胞數(shù)量。

1.2.6ELISA檢測取右肺新鮮組織，加入4 ℃生理鹽水勻漿(1 g 組織加入2 mL生理鹽水)，2 500 r · min-1離心10 min，取上清液，ELISA法檢測其中NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13含量。ELISA操作嚴格按說明書進行。

草酸銨法避免了高酸環(huán)境給操作人員帶來的傷害，但草酸銨本身有毒，高溫條件下會釋放出氨氣。所以，該法的生產安全性、環(huán)境影響以及工業(yè)可行性還有待研究。其基本原理是草酸銨中的草酸根離子能與果膠酸中的鈣反應生成可溶性果膠銨鹽[21]。

2結果

2.1APS對BALF中炎癥細胞數(shù)量的影響與正常組比較，哮喘組BALF中含有更多數(shù)量的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞及中性粒細胞(P<0.05)；與哮喘組比較，APS組BALF中上述炎癥細胞數(shù)量均明顯降低(P<0.05)；但APS組上述炎癥細胞數(shù)量仍明顯高于正常組(P<0.05)。見Tab1。

#P<0.05vsnormal group;△P<0.05vsasthma

2.2APS對大鼠肺組織形態(tài)學病變的影響HE染色顯示，正常組未見異常，肺泡輪廓完整清晰，未見明顯的炎癥細胞浸潤。哮喘組肺泡輪廓欠清晰，肺泡壁明顯水腫、增厚，部分肺泡擴張，大量炎癥細胞浸潤。與哮喘組比較，APS組肺泡輪廓較清晰，肺泡壁水腫明顯減輕、炎癥細胞浸潤明顯減輕；但與正常組比較，APS組仍存在較明顯的肺泡壁水腫、炎癥細胞浸潤等表現(xiàn)。見Fig 1。

2.3APS對大鼠肺泡Ⅰ型上皮細胞超微結構的影響電鏡下可見，哮喘組大鼠肺泡Ⅰ型上皮細胞線粒體腫脹、嵴模糊，高爾基復合體不發(fā)達，染色質聚集。與哮喘組比較，APS組大鼠肺泡Ⅰ型上皮細胞上述超微結構變化明顯減輕。見Fig 2。

2.4APS對大鼠肺NF-κB信號通路活性的影響與正常組比較，哮喘組肺部NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα含量明顯升高(P<0.05)。與哮喘組比較，APS組肺部NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα含量明顯降低(P<0.05)；但APS組上述指標含量仍高于正常組(P<0.05)。見Tab2。

#P<0.05vsnormal group;△P<0.05vsasthma

2.5APS對大鼠肺MAPK信號通路活性的影響與正常組大鼠比較，哮喘組肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量明顯升高(P<0.05)。與哮喘組比較，APS組肺部上述指標含量明顯降低(P<0.05)；但APS組上述指標含量仍高于正常組(P<0.05)。見Tab3。

2.6APS對大鼠肺細胞因子的影響與正常組比較，哮喘組肺組織炎性細胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13含量明顯增高(P<0.05)。與哮喘組比較，APS組上述細胞因子含量明顯降低(P<0.05)；但APS組含量仍高于正常組(P<0.05)。見Tab4。

3討論

本研究首先觀察了APS對哮喘大鼠肺部炎癥的影響，結果表明，APS明顯降低了哮喘大鼠BALF炎癥細胞數(shù)量、抑制了肺組織炎癥反應。肺泡Ⅰ型上皮對于維持正常的肺功能具有重要的作用，哮喘時該上皮易受累，導致呼吸功能下降。本研究結果顯示，APS明顯改善了OVA誘導的肺泡Ⅰ型上皮超微結構損傷。既往研究也就APS對哮喘的療效進行了探討，宋澤慶等發(fā)現(xiàn)APS對哮喘小鼠特異性免疫治療具有增強作用。俞建芬等報道APS可改善哮喘小鼠氣道高反應性及氣道重塑。課題組前期研究顯示APS可調節(jié)哮喘大鼠Th17/Treg細胞因子平衡[6]。這些研究均證明APS對哮喘具有治療作用。

近年研究顯示，NF-κB/MAPK信號通路過度激活在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮作用[3-4]。通常NF-κB被IκB抑制，以非活性形式存在于細胞質。當IκB發(fā)生磷酸化，失去了對NF-κB的抑制作用，活化的磷酸化-NF-κB可轉位至細胞核，促進基因轉錄，繼而增加炎性細胞因子表達，促進哮喘發(fā)展。本研究顯示，哮喘組NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα表達升高，表明NF-κB通路過度激活。其他研究也顯示哮喘動物NF-κB通路活性較正常動物增加[9-10]，與本研究結果一致。本研究中，APS組大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα表達較哮喘組明顯降低，表明APS可明顯抑制NF-κB通路活性。MAPK信號通路在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，MAPK信號通路主要包括分別由ERK1/2、JNK、p38 MAPK介導的三條級聯(lián)反應，該通路的激活可促進炎癥細胞因子的生成而加劇炎癥反應。有研究表明哮喘動物MAPK信號通路較正常動物活性增強[11]。本研究顯示，哮喘組大鼠肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量較正常組明顯升高，這與既往報道相一致[11-13]。本研究中，APS明顯降低了哮喘大鼠肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量，表明APS可抑制OVA誘導的MAPK信號通路過度激活。

#P<0.05vsnormal group；△P<0.05vsasthma group

#P<0.05vsnormal group；△P<0.05vsasthma group

本研究尚檢測了大鼠肺部NF-κB/MAPK信號通路下游炎性細胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13的表達。結果表明哮喘組大鼠上述細胞因子水平明顯升高，這同既往其他研究報道一致[14-16]。在本研究中，與APS抑制NF-κB/MAPK信號通路的過度激活相一致，APS也明顯抑制了哮喘大鼠炎性細胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13表達。

綜上所述，OVA引起了大鼠NF-κB/MAPK信號通路過度激活以及炎性細胞因子過度分泌。與文獻報道一致，上述通路的激活以及炎性細胞因子的過度分泌，可引起炎癥級聯(lián)反應、加劇肺部炎癥，促進肺上皮損傷，增加氣道反應性，并引起氣道重構[3-4,17-18]。針對此，大量研究以藥物對哮喘進行干預，旨在降低NF-κB/MAPK信號通路的過度激活及炎癥因子的過度分泌，結果表明能改善上述靶點的藥物，可明顯減輕哮喘病變[3-4,19]。本研究中，APS亦明顯降低了OVA引起的NF-κB/MAPK信號通路過度激活及炎癥因子過度分泌，同時減輕了肺部炎癥以及肺泡Ⅰ型上皮細胞超微結構損傷，理論上推測大鼠哮喘表現(xiàn)的好轉可能與APS抑制NF-κB/MAPK信號通路及炎癥因子水平有關。在既往報道中，雖然有眾多的中藥提取物表現(xiàn)出了一定的抗哮喘作用，但與陽性對照藥物糖皮質激素比較，多數(shù)提取物均未達到或優(yōu)于糖皮機制激素的療效[20-21]。與此類似，本研究中APS雖然明顯抑制了NF-κB/MAPK信號通路及炎癥因子分泌，但其水平仍明顯高于正常對照組，與此一致，APS組雖然肺部炎癥得到緩解，但與正常組比較，仍然存在顯著的炎癥，故APS對哮喘時的肺部炎癥僅有部分緩解作用。

總之，APS可明顯緩解哮喘大鼠肺部炎癥反應，同時減低了NF-κB/MAPK信號通路活性。故推測，APS改善哮喘的作用可能與抑制NF-κB/MAPK信號通路有關。

(致謝：本研究在山東省濰坊醫(yī)學院應用藥理學實驗室完成。)

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Astragalus polysaccharide regulates NF-κB/MAPK signaling pathway and attenuates airway inflammation in OVA-induced asthmatic rats

WANG Jin-lei1, LI Cheng-de1, SUN Hong-wei2, MAO Shu-mei1， ZHANG Xiao-jun1, QU Mei-hua1

(1.DeptofPharmacology; 2.DeptofPsychology,WeifangMedicalCollege,WeifangShandong261053,China)

Key words：astragalus polysaccharide; asthma; inflammation；NF-κB/MAPK signaling pathway; effect; mechanism

Abstract：AimTo detect the possible ameliorative effects of APS on the airway inflammation and whether the effects are associated with inhibiting the NF-κB/MAPK signaling pathway in ovalbumin(OVA)-induced asthmatic rats. MethodsAsthma was induced by OVA sensitization and challenge. The asthmatic rats in the APS group were treated with APS. Pulmonary inflammation was assessed with hematoxylin and eosin staining and inflammatory cell counting in BALF. Ultrastructural changes of type I pneumocyte were observed by electron microscopy. Levels of NF-κB p65, p-NF-κB p65, p-IκBα, ERK1/2, p-ERK1/2, JNK, p-JNK, p38 MAPK, p-p38 MAPK, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-13 were measured using ELISA to assess the activity of NF-κB/ MAPK signaling pathway. ResultsCompared to the normal group, OVA induced significantly pulmonary inflammation and ultrastructural changes of type I pneumocyte in the asthma group. Besides, OVA increased the activity of the NF-κB/MAPK signaling pathway and promoted the production of inflammatory cytokines IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-13 in the asthma group. If compared to the asthma group, APS markedly attenuated the pulmonary inflammation and type I pneumocyte damage, as well as inhibited the activity of the NF-κB/MAPK signaling pathway and decreased the production of inflammatory cytokines in the APS group. ConclusionThe ameliorative effects of APS on airway inflammation might be associated with the inhibition of the activity of the NF-κB/MAPK signaling pathway.

收稿日期：2015-12-03，修回日期：2016-02-22

基金項目：山東省自然科學基金資助項目(No ZR2009CL045, ZR2011HL066, ZR2013CM033, ZR2015CL029)；山東省教育廳科技計劃項目(No J15LL54，J14LL55)；山東省中醫(yī)藥管理局項目(No 2013-242, 2015-237)

作者簡介：王金磊 (1987-)，男，碩士生，研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病，Tel: 0536-2769729，E-mail: 623525679@qq.com； 毛淑梅(1976-)，女，副教授，碩士生導師，研究方向：呼吸系統(tǒng)藥理、內分泌藥理學，通訊作者，Tel: 0536-8985866，E-mail: maoshumei@126.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.03.010

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0489-05

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R329.25；R364.5；R562.250.531

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.020.html