楊　彪，李新鳴，嚴(yán)思遠(yuǎn)，陳冬梅，牛佳鈺，肖純凌

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科，遼寧 沈陽　110032；2. 沈陽醫(yī)學(xué)院環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽　110034)

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應(yīng)用冷光源內(nèi)窺鏡和點(diǎn)樣吸頭完成的新型小鼠氣管滴注法

楊彪1，李新鳴2，嚴(yán)思遠(yuǎn)2，陳冬梅2，牛佳鈺2，肖純凌2

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科，遼寧 沈陽110032；2. 沈陽醫(yī)學(xué)院環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽110034)

摘要：目的建立一套新型易操作的小鼠氣管插管、滴注方法。方法依靠冷光源內(nèi)窺鏡和電泳點(diǎn)樣吸頭為插管工具，建立一套新型的插管操作系統(tǒng)。利用高倍放大，完成小鼠氣管插管、滴注，研究中1周內(nèi)對(duì)20只♂ CB17-SCID小鼠(體質(zhì)量24～28 g)進(jìn)行插管和滴注80 μL環(huán)境污染細(xì)顆粒物懸液。結(jié)果共完成80次插管、滴注操作，末次滴注24 h后解剖小鼠可見氣管低端和肺內(nèi)有散在的空氣污染細(xì)顆粒物分布。結(jié)論應(yīng)用冷光源內(nèi)窺鏡和電泳點(diǎn)樣吸頭進(jìn)行的氣管滴注新方法操作快速、簡(jiǎn)潔、可重復(fù)性好，能夠廣泛用于小鼠呼吸系統(tǒng)的插管和滴注操作。

關(guān)鍵詞：氣管滴注新方法；冷光源內(nèi)窺鏡；點(diǎn)樣槍頭；小鼠；實(shí)驗(yàn)技術(shù)；氣管插管

隨著呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的深入研究，很多科研機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室對(duì)小鼠氣管滴注操作方法不斷的進(jìn)行革新，隨之成功有效的技術(shù)手段得到廣泛的應(yīng)用。為了本課題組開展進(jìn)一步科學(xué)研究的需要，我們建立了應(yīng)用冷光源內(nèi)窺鏡直視技術(shù)進(jìn)行小鼠氣管滴注的新方法，這種方法的應(yīng)用和推廣將從經(jīng)濟(jì)和技術(shù)層面幫助到更多實(shí)驗(yàn)室的科研人員。本文簡(jiǎn)要描述具體的操作方法和要點(diǎn)，期待與廣大研究者進(jìn)行探討和學(xué)習(xí)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物20只清潔級(jí)♂ CB17-SCID小鼠[體質(zhì)量24～28 g，許可證號(hào)：SCXK (京) 2012-0001]購于北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，12/12 h晝夜光照，動(dòng)物房溫度為22～24℃，濕度為70%。

1.1.2材料乙醚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、冷光源硬性內(nèi)窺鏡(外徑2.7 mm, 徐州科能光電設(shè)備有限公司)、1～200 μL Pipette Tip (Thermo Fisher, Cat.# 010-Q)、2-20μL單通道移液器(Eppendorf, Germany)、空氣污染細(xì)顆粒物懸液(實(shí)驗(yàn)室保留)、鈍頭鑷子、50 mL離心管、棉球以及自行購置和設(shè)計(jì)的小鼠口腔撐開裝置(1#手術(shù)線、鐵架臺(tái))。如Fig 1所示。

1.2操作方法

1.2.1操作人員首先在50 mL離心管底部填充約10 mL左右空間的棉球，然后用加長(zhǎng)巴氏吸管向棉球內(nèi)部添加5 mL乙醚液體(大約能麻醉10只小鼠)，如果需要不斷的增加小鼠麻醉數(shù)量，適時(shí)補(bǔ)充乙醚的使用劑量。對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉處理，觀察小鼠的呼吸頻率，待呼吸由急促轉(zhuǎn)慢時(shí)，將其上牙掛置于固定于鐵架臺(tái)的手術(shù)線上面(Fig 2)，此時(shí)如果小鼠蘇醒，重復(fù)進(jìn)行麻醉。用鈍頭鑷子將其舌部拉出固定，并將小鼠整個(gè)軀體固定，使口腔撐開便于另一操作人員完成氣管插管的處理。

1.2.2操作人員一手持冷光源內(nèi)窺鏡，觀察開閉的聲門(Fig 3)，一手持移液器，待聲門關(guān)閉前準(zhǔn)確完成氣管滴注過程，完成滴注過程的操作者要熟練冷光源內(nèi)窺鏡和插管工具點(diǎn)樣吸頭間的配合。完成上述操作內(nèi)容平均每只動(dòng)物需要2～3 min。

2結(jié)果

所有實(shí)驗(yàn)小鼠氣管滴注均獲得成功。滴注方法測(cè)試，將小鼠處死后，解剖可見氣管下端至肺部位置均有黑色物質(zhì)散在分布(Fig 4)，判定實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法有效，氣管滴注成功。

3討論

隨著近年各學(xué)科研究的飛速發(fā)展，進(jìn)行呼吸道給藥染毒操作的小鼠實(shí)驗(yàn)的需求呈上升趨勢(shì)。但是由于小鼠口腔狹小，很難通過眼睛直視觀察到聲門，即氣管的開口，所以對(duì)小鼠的氣管插管操作很多研究者采用手術(shù)暴露頸部氣管的方式，這種方法易操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的損傷大[1-3]。其他相關(guān)研究也對(duì)非手術(shù)方式小鼠氣管滴注方法進(jìn)行了介紹[4-8]，但操作方法都過于繁瑣，或是用藥的劑量無法進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)算。

The arrows displayed fine particulate matters with successful instillation. A: The picture of lung tissue for tracheal instillation and performed with paraformaldehyde; B: The picture of instilled lung tissue on anatomic observation method

應(yīng)用冷光源內(nèi)窺鏡和點(diǎn)樣吸頭完成的小鼠氣管滴注法具有以下優(yōu)點(diǎn)：① 電泳點(diǎn)樣槍頭的應(yīng)用，對(duì)于操作者更加的簡(jiǎn)便，使插管操作靈活，可重復(fù)完成，同時(shí)對(duì)于小鼠更加的安全，電泳點(diǎn)樣吸頭有一定的韌性和彎曲性，并且前端較細(xì)一級(jí)吸頭可以插入到支氣管附近位置，是一個(gè)理想的小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)插管工具。② 冷光源直桿內(nèi)窺鏡所選擇的冷光源不會(huì)燙傷小鼠的口腔和氣管部位組織，避免了組織損傷所引起的一系列炎癥反應(yīng)，另外鏡頭可以將小鼠氣管的聲門放大3倍以上，便于操作者觀察，從而更加順利的完成插管實(shí)驗(yàn)。③ 如果是完成連續(xù)滴注實(shí)驗(yàn)，可以用戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，對(duì)小鼠口腔通過手術(shù)線掛牙的方式打開，進(jìn)行點(diǎn)樣吸頭可視化插管；如果完成單次的氣管滴注實(shí)驗(yàn)，用乙醚對(duì)小鼠麻醉，借助可視化移液器加樣的方法進(jìn)行氣管滴注。

操作的注意事項(xiàng)：①控制麻醉的深度，當(dāng)小鼠的呼吸頻率由快到慢時(shí)，10 s后從麻醉容器中取出，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；②用鑷子向外拉動(dòng)舌頭要適度，既要保證撐開口腔，又要避免損傷到小鼠；③滴注前，要對(duì)點(diǎn)樣吸頭插管深度進(jìn)行解剖觀測(cè)；④滴注時(shí)，由于操作空間較小，先放入點(diǎn)樣吸頭，再用冷光源內(nèi)窺鏡觀察聲門和吸頭進(jìn)行下一步操作；⑤為了保證實(shí)驗(yàn)的成功，還需進(jìn)行滴注液體體積的測(cè)試，通常滴注液體為20～50 μL；⑥注意觀察聲門時(shí)不要使點(diǎn)樣吸頭接觸到食管，以免產(chǎn)生氣泡黏液，影響插管實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，采用實(shí)驗(yàn)室常用的點(diǎn)樣吸頭和一種冷光源內(nèi)窺鏡，大膽的改進(jìn)和創(chuàng)新了實(shí)驗(yàn)操作的滴注方法，熟練此種技術(shù)只需經(jīng)過數(shù)次初步的練習(xí)即可實(shí)施實(shí)驗(yàn)?？梢姡瑧?yīng)用冷光源內(nèi)窺鏡和電泳點(diǎn)樣吸頭進(jìn)行的氣管滴注新方法操作快速、簡(jiǎn)潔，可重復(fù)性好，能夠廣泛用于小鼠呼吸系統(tǒng)的插管和滴注操作。

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A new method of mouse tracheal instillation with endoscope of cold light and gel loading tips

YANG Biao1, LI Xin-ming2, YAN Si-yuan2, CHEN Dong-mei2, NIU Jia-yu2, XIAO Chun-ling2

(1.BasicDisciplineofChineseandWesternIntegrative，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China;2.KeyLabofEnvironmentalPollutionandMicroecology,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

Key words:new method of endotracheal instillation; endoscope of cold light; gel loading tips; mice; experimental techniques; endotracheal intubation

Abstract:AimTo develop a new method for easy endotracheal intubation and instillation in mice. MethodsRelying on the endoscope of cold light and gel loading tips, a new method was set up for intubated operations. Under high magnification, operations of endotracheal intubation and instillation were completed in mice. Twenty male CB17-SCID mice (between 24 and 28 g) were repeatedly intubated and instilled with 80 μL suspensions of air polluted fine particulate matters in a week. ResultsThe twenty mice were sacrificed after 24h of the last instillation. The dispersions of the air polluted fine particulate matters were found at the bottoms of tracheas and in both the left and right lungs in all mice. ConclusionUsing the endoscope of cold light and gel loading tips, a new method for tracheal instillation is set up in mice, which is rapid, simple and has good repeatability. It could be widely applied for the endotracheal intubation and instillation in mice.

收稿日期：2015-12-29，修回日期：2016-02-17

基金項(xiàng)目：沈陽市環(huán)境污染與重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)(No F14-181-1-00)；沈陽市科技局計(jì)劃項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：楊彪(1984- )，男，2014級(jí)博士生，研究方向：環(huán)境污染物對(duì)呼吸系統(tǒng)影響，Tel: 024-62215695, E-mail: y49781775@126.com； 肖純凌(1964- )，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：大氣污染對(duì)呼吸道的影響機(jī)制及微生態(tài)，通訊作者,Tel： 024-62215656, E-mail: xiaochunling@symc.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.028

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)04-0585-03

中國圖書分類號(hào)：R-332；R322.33；R332；R452；R472.9

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.056.html