丁少楨，丁　浩，梅　俏，劉曉昌，胡　靜，胡詠梅，許建明

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥　230022)

?

同型半胱氨酸調(diào)控MEK-ERK-MLCK通路影響結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性的實驗研究

丁少楨，丁浩，梅俏，劉曉昌，胡靜，胡詠梅，許建明

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥230022)

摘要：目的探討同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是否通過調(diào)控MEK-ERK-MLCK通路影響結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性的機制。方法SD大鼠分為4組，A組為正常對照組(NS皮下注射+NS灌腸)，B組為正常對照+Hcy注射組(Hcy皮下注射+NS灌腸)，C組為TNBS模型組(NS皮下注射+TNBS灌腸)，D組為TNBS模型+Hcy注射組(Hcy皮下注射+TNBS灌腸)。建立高Hcy血癥的實驗性結(jié)腸炎大鼠模型，實驗結(jié)束時取大鼠結(jié)腸組織病理學檢查，并進行結(jié)腸勻漿檢測MPO活性，采用Western blot方法檢測大鼠小腸組織中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK的蛋白表達水平，采用RT-qPCR方法檢測大鼠小腸組織中MLCK mRNA表達。結(jié)果與正常對照組及模型對照組相比，TNBS模型+Hcy皮下注射組大鼠DAI及HI評分增高，結(jié)腸勻漿MPO活性增高，小腸黏膜組織MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表達水平增加，MLCK mRNA相對表達量增加。結(jié)論Hcy增加實驗性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性，可能與調(diào)控MEK-ERK-MLCK信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；炎癥性腸?。荒c黏膜通透性；緊密連接；肌球蛋白輕鏈激酶；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶

腸黏膜通透性增加在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的病理生理過程中具有重要作用[1]。緊密連接(tight junction，TJ)是構(gòu)成腸黏膜上皮細胞機械屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[2]，TJ損傷引起腸黏膜屏障破壞，導致腸黏膜通透性增加，參與IBD的病理生理過程。TJ的結(jié)構(gòu)蛋白主要由跨膜蛋白家族(包括Claudin及Occludin)和外周支架蛋白ZO構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)通過調(diào)節(jié)Claudin、Occludin及ZO蛋白表達，可以引起腸黏膜通透性增加[3]，MLCK在TJ通透性動態(tài)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[4]。調(diào)控MLCK的信號通路主要包括ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，MEK激活ERK引起ERK磷酸化，ERK1/2通路激活導致Elk-1的激活與磷酸化，激活的Elk-1遷移到細胞核內(nèi)，與MLCK結(jié)合并激活MLCK[5]。

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，是體內(nèi)蛋氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，IBD患者血漿和結(jié)腸黏膜組織中Hcy含量明顯增高[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy通過促進基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)合成，破壞內(nèi)皮細胞屏障，增加內(nèi)皮細胞通透性，這一過程與調(diào)控ERK-MLCK通路有關(guān)[8]。但Hcy是否通過調(diào)控MEK-ERK-MLCK通路影響腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)及功能尚不明確。因此，本研究擬在建立大鼠TNBS/乙醇結(jié)腸炎模型的基礎(chǔ)上，探討Hcy是否通過調(diào)控MEK-ERK-MLCK信號通路影響腸黏膜通透性的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物和試劑SD大鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量(200±20) g，由安徽省動物中心提供，實驗動物許可證號：34000200000480，在室溫、光照周期12 h：12 h條件下適應性飼養(yǎng)1周使用。TNBS(031 M5021)、DL-同型半胱氨酸(121M39044)均購自Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組實驗大鼠分為4組，每組8只。A組(正常對照組)：生理鹽水灌腸+生理鹽水皮下注射；B組(正常對照+Hcy注射組)：生理鹽水灌腸+Hcy皮下注射；C組(TNBS模型組)：TNBS/乙醇溶液灌腸+生理鹽水皮下注射；D組(TNBS模型+Hcy注射組)：TNBS/乙醇溶液灌腸+ Hcy皮下注射。

1.2.2模型制備和給藥方法參照文獻方法[9]，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用橡膠管經(jīng)肛門插入大鼠結(jié)腸內(nèi)8 cm左右，注入以等體積乙醇溶解的TNBS(100 mg·kg-1)溶液。對照組灌腸等體積生理鹽水。DL-Hcy溶于NS，滴定pH至7.4，參照文獻劑量[10]自TNBS模型制備后d1起皮下注射Hcy(0.03 umol·g-1)，每天2次，間隔8 h，連續(xù)30 d。對照組皮下注射等體積生理鹽水。

1.2.3標本采集10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分別切取遠端結(jié)腸及末段小腸約8 cm，沿縱軸剪開腸管，冰生理鹽水沖洗干凈后取部分結(jié)腸及小腸進行檢測。

1.2.4結(jié)腸炎癥評價實驗過程中每日觀察大鼠體重變化和大便性狀，每日觀察或用糞便隱血試紙檢測大便帶血情況，按文獻方法[11]行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分。實驗結(jié)束后于全麻下處死大鼠，取遠端結(jié)腸甲醛固定，石蠟包埋后行HE染色，按文獻方法[12]行組織學評分(histological index, HI)。

1.3檢測方法

1.3.1結(jié)腸勻漿MPO活性檢測取結(jié)腸組織制備10%結(jié)腸組織勻漿，采用四甲基聯(lián)苯胺法[13]檢測結(jié)腸MPO活性。

1.3.2大鼠結(jié)腸勻漿MLCK及Hcy水平檢測ELISA法檢測大鼠結(jié)腸勻漿MLCK，Hcy水平。

1.3.3Western blot法檢測大鼠小腸黏膜組織MLCK、p-MLCK、MEK、ERK、p-ERK蛋白表達取小腸黏膜組織，加入RIPA細胞裂解液進行裂解，離心后收集上清液。加入等量的2X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水加熱10 min，上樣，電泳，用電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯(PVDF)膜上，加入Western封閉液(5%脫脂奶粉)，封閉PVDF膜非特異抗原，依次加一抗、二抗孵育，ECL試劑盒曝光和顯影。

1.3.4RT-qPCR法檢測大鼠小腸黏膜組織MLCK mRNA表達提取小腸黏膜組織mRNA、去除基因組DNA、合成cDNA后，按試劑盒說明書進行加樣：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s退火，72℃延伸，40個循環(huán)。分析方法為：relative quantification study，分析指標為：2^-ΔΔCt。MLCK引物序列：Forward primer: 5′-CCTGAGGAGAACAAGGAGCA-3′;Reverse primer, 5′- TTCTGGCTCTCTTCCCACAG-3′，產(chǎn)物長度113 bp。

2結(jié)果

2.1Hcy對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸炎癥損傷的影響結(jié)腸炎模型組大鼠出現(xiàn)稀便或肉眼血便等癥狀以及體重下降。結(jié)腸組織病理提示結(jié)腸黏膜及黏膜下層炎細胞浸潤，局部水腫、糜爛，并伴有潰瘍形成。與正常對照組及TNBS模型對照組比較，TNBS模型+Hcy皮下注射組大鼠體重明顯減輕，DAI及HI評分升高，結(jié)腸勻漿MPO活性升高，同時結(jié)腸勻漿中Hcy水平明顯增高，提示Hcy加重結(jié)腸炎癥病理損傷(Fig 1, Tab1)。

2.2Hcy對結(jié)腸炎大鼠小腸黏膜組織中MLCK、p-MLCK蛋白及mRNA表達的影響與正常對照組比較，TNBS模型對照組大鼠小腸黏膜上皮細胞MLCK水平升高，MLCK和p-MLCK蛋白表達增加。與TNBS模型對照組相比，TNBS模型+Hcy注射組大鼠小腸黏膜上皮細胞MLCK水平，MLCK和p-MLCK蛋白表達明顯增加(P<0.05)，提示Hcy可能參與影響了MLCK磷酸化過程(Tab2,Fig 2,Tab3)。

A: Normal group; B: Normal+Hcy group, C: TNBS/ethanol group, D: TNBS/ethanol+Hcy group

A: Normal group; B: Normal+Hcy group, C: TNBS/ethanol group, D: TNBS/ethanol+Hcy group.**P<0.01vsGroup A;##P<0.01vsGroup C

Note see Tab1

A: Normal group; B: Normal+Hcy group, C: TNBS/ethanol group, D: TNBS/ethanol+Hcy group

與正常對照組比較，TNBS模型對照組大鼠小腸黏膜上皮細胞MLCK mRNA表達增加。與TNBS模型對照組相比，TNBS模型+Hcy注射組大鼠小腸黏膜上皮細胞MLCK mRNA明顯增加(P<0.05)(Fig 3)。

2.3Hcy對結(jié)腸炎大鼠小腸黏膜組織中MEK、ERK、p-ERK蛋白表達的影響與正常對照組相比，TNBS模型對照組大鼠小腸黏膜組織MEK、ERK、p-ERK蛋白表達增加。與TNBS模型對照組相比，TNBS模型+Hcy注射組大鼠小腸黏膜上皮細胞MEK、ERK、p-ERK表達明顯增加，提示Hcy可能參與了MEK-ERK-MLCK蛋白磷酸化調(diào)控過程(Fig 4，Tab3)。

3討論

IBD的發(fā)病機制目前尚不明確，腸黏膜通透性降低，引起腸黏膜屏障功能損害在IBD的病理生理過程中具有重要作用[14]。腸黏膜屏障損害可加重腸黏膜炎癥和免疫反應，被認為是感染和免疫因素啟動腸道炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由腸黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等組成的機械屏障是腸黏膜屏障的重要結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射Hcy的結(jié)腸炎大鼠小腸組織EB含量明顯增高，小腸黏膜上皮細胞間隙明顯增寬，并且伴有緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞，抑制Claudin-1、Occludin和ZO-1表達，提示Hcy可能損傷小腸黏膜上皮細胞連接，增加腸黏膜通透性，進一步加重腸道炎癥損傷過程。

A: Normal group; B: Normal+Hcy group, C: TNBS/ethanol group, D: TNBS/ethanol+Hcy group.*P<0.05vsTNBS control group after one-way ANOVA

A: Normal group; B: Normal+Hcy group, C: TNBS/ethanol group, D: TNBS/ethanol+Hcy group

MLCK介導的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化信號通路是調(diào)控緊密連接功能的重要信號通路[4,15]。MLCK是一種Ca2+/鈣調(diào)蛋白(calmodulin, Cam)依賴的蛋白激酶。Ca2+/CaM復合體能夠與MLCK結(jié)合，解除MLCK的天然抑制序列，形成激活的p-MLCK[16-17]。p-MLCK能夠使MLC的Ser19和Thr18發(fā)生磷酸化[18]，MLC空間構(gòu)象發(fā)生改變[19]，促進肌動蛋白與肌球蛋白絲收縮，使上皮細胞TJ開放，調(diào)節(jié)上皮細胞黏膜通透性[20]。因此，MLCK在腸黏膜上皮細胞TJ損傷與修復過程中起重要作用。研究表明，MLCK基因過表達的小鼠肺血管上皮通透性增強[21]。MLCK特異性抑制劑能夠降低細胞內(nèi)p-MLC水平，恢復腸黏膜屏障功能[22-24]葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎小鼠腸黏膜中MLCK活性增高，導致腸黏膜通透性增加，加重了腸道炎癥損傷[25]。ERK可以調(diào)控MLCK磷酸化，如MLCK激活引起內(nèi)皮細胞收縮，細胞間隙增寬，脂質(zhì)進入內(nèi)皮下層，加速動脈粥樣硬化改變[26]。

A: Normal group; B: Normal+Hcy group, C: TNBS/ethanol group, D: TNBS/ethanol+Hcy group.*P<0.05vsGroup C.

Hcy通過促進TNF-α、IL-6、IFN- γ等炎癥因子表達[27]，激活NADPH、p38MAPK[28-29]等途徑引起氧化損傷，是多種心腦血管疾病的獨立危險因素[30]。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可通過ERK-MLCK信號調(diào)控通路促進MMP-9合成，參與內(nèi)皮細胞通透性下調(diào)過程，引起腦血管重塑。

既往研究表明，IBD病人血漿以及腸黏膜組織Hcy水平明顯增高，提示Hcy可能影響IBD患者腸黏膜通透性[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy增加實驗性結(jié)腸炎大鼠小腸組織中MLCK、p-MLCK、ERK、MEK、p-ERK的mRNA和蛋白表達，提示Hcy可能通過促進MEK-ERK-MLCK蛋白磷酸化過程，損傷腸上皮細胞緊密連接，引起腸黏膜通透性增加，加重腸道炎癥過程，為闡明IBD中Hcy影響腸黏膜通透性的作用機制提供實驗依據(jù)。

參考文獻:

[1]Mankertz J, Schulzke J D. Altered permeability in inflammatory bowel disease: pathophysiology and clinical implications[J].CurrOpinGastroenterol,2007,23(4): 379-83.

[2]Shen L. Tight junctions on the move: molecular mechanisms for epithelial barrier regulation[J].AnnNYAcadSci,2012,1258:9-18.

[3]Blair S A, Kane S V, Clayburgh D R, Turner J R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease[J].LabInvest, 2006, 86(2):191-201.

[4]Turner J R. Molecular basis of epithelial barrier regulation: from basic mechanisms to clinical application[J].AmJPathol,2006, 169(6): 1901-9.

[5]Al-Sadi R, Guo S, Ye D, Ma T Y. TNF-α modulation of intestinal epithelial tight junction barrier is regulated by ERK1/2 activation of Elk-1[J].AmJPathol, 2013, 183(6):1871-84.

[6]Erzin Y, Uzun H, Celik A F, et al. Hyperhomocysteinemia in inflammatory bowel disease patients without past intestinal resections: Correlations with cobalamin, pyridoxine, folate concentrations, acute phase reactants, disease activity, and prior thromboembolic complications[J].JClinGastroenterol, 2008, 42(5):481-6.

[7]Oussalah A,Guéant J L, Perin-Biroulet L. Meta-analysis: hyperhomocysteinaemia in inflammatory bowel diseases[J].AlimentPharmacolTher, 2011, 34(10):1173-84.

[8]Tyagi N, Gillespie W, Vacek J C, et al. Activation of GABA-A receptor ameliorates homocysteine-induced MMP-9 activation by ERK pathway[J].JCellPhysiol, 2009, 220(1):257-66.

[9]Morris G P, Beck P L, Herridge M S, et al. Hapten induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology, 1989, 96(3):795-803.

[10]Scherer E B, da Cunha A A, Kolling J, et al. Development of an animal model for chronic mild hyperhomocysteinemia and its response to oxidative damage[J].IntJDevNeuroscience, 2011, 29(7):693-9.

[11]Vowinkel T, Kalogeris T J, Mori M, et al. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis[J].DigDisSci, 2004, 49(4):556-4.

[12]Videla S, Vilaseca J, Medina C, et al. Selective Inhibition of phosphodiesterase-4 Ameliorates Chronic Colitis and Prevents Intestinal Fibrosis[J].JPharmacolExpTher, 2006,316(2):940-5.

[13]Quade M J, Roth J A. A rapid, direct assay to measure degranulation of bovine neutrophil primary granules[J].VetImmunolImmunopathol,1997, 58(3-4):239-48.

[14]Clayburgh D R, Shen L, Turner J R. A porous defense: the leaky epithelial barrier in intestinal disease[J].LabInvest, 2004,84(3):282-91.

[15]Elamin E, Jonkers D, Juuti-Uusitalo K, et al. Effects of ethanol and acetaldehyde on tight junction integrity:invitrostudy in a three dimensional intestinal epithelial cell culture model[J].PloSOne, 2012, 7(4): e35008.

[16]Kamm K E，Stull J T. Dedicated myosin light chain kinases with diverse cellular functions[J].JBiolChem, 2001, 276(7) : 4527-30.

[17]Hong F, Haldeman B D, Jackson D, et al. Biochemistry of smooth muscle myosin light chain kinase[J].ArchBiochemBiophys, 2011, 510(2):135-46.

[18]Hong F, Haldeman B D, John O A, et al. Characterization of tightly associated smooth muscle myosin-myosin light-chain kinase-calmodulincomplexes[J].JMolBiol，2009，390(5):879-92.

[19]Herring B P, El-Mounayri O, Gallagher P J,et al. Regulation of myosin light chain kinase and telokin expression in smooth muscle tissues[J].AmJPhysiolCellPhysiol, 2006, 291(5):817-27.

[20]Fazal F, Gu L, Ihnatovych I, et al. Inhibiting myosin light chain kinase induces apoptosisinvitroandinvivo[J].MolCellBiol, 2005, 25(14):6259-66.

[21]Wang T, Moreno-Vinasco L, Ma S F,et al. Nonmuscle myosin light chain kinase regulates murine asthmatic inflammation[J].AmJRespirCellMolBiol, 2014, 50(6):1129-35.

[22]Clayburgh D R, Barrett T A, Tang Y, et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrheainvivo[J].JClinInvest, 2005, 115(10):2702-15.

[23]Moriez R, Salvador-Cartier C, Theodorou V, et al. Myosin light chain kinase is involved in lipopolysaccharide-induced disruption of colonic epithelial barrier and bacterial translocation in rats[J].AmJPathol, 2005, 167:1071-9.

[24]Shen L, Black E D, Witkowski E D,et al. Myosin light chain phosphorylation regulates barrier function by remodeling tight junction structure[J].JCellSci, 2006, 119(10):2095-106.

[25]黃健，梅俏，韓亮，等. 環(huán)孢素A對DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性影響及其機制的研究[J]. 中國藥理學通報，2012，28(10)：1468-71.

[25]Huang J, Mei Q, Han L, et al. Effect of Cyclosporin A on the intestinal mucosal permeability of colitis in mice[J].ChinPharmacolBull, 2012，28(10)：1468-71.

[26]Cheng X, Wang X, Wan Y,et al. Myosin light chain kinase inhibitor ML7 improves vascular endothelial dysfunction via tight junction regulation in a rabbit model of atherosclerosis[J].MolMedRep, 2015, 12(3):4109-16.

[27]Danese S, Sgambato A, Papa A, et al. Homocysteine triggers mucosal microvascular activation in inflammatory bowel diease[J].AmJGastroenterol, 2005, 100:886-95.

[28]Wang X, Cui L, Joseph J,et al. Homocysteine induces cardiomyocyte dysfunction and apoptosis through p38 MAPK-mediated increase in oxidant stress[J].JMolCellCardiol, 2012, 52(3):753-60.

[29]Abais J M, Zhang C, Xia M,et al. NADPH oxidase-mediated triggering of inflammasome activation in mouse podocytes and glomeruli during hyperhomocysteinemia[J].AntioxidRedoxSignal, 2013,18(13):1537-48.

[30]耿彬，常林，杜軍保，唐朝樞. 防治高同型半胱氨酸血癥的新策略[J]. 北京大學學報·醫(yī)學版，2005, 37(2): 215-9.

[30]Geng B, Chang L, Du J B, Tang C S. A new strategy to treat hyperhomocysteinemia[J].BeijingDaXueXueBao,2005, 37(2): 215-9.

[31]劉曉昌，梅俏，黃健，等. 同型半胱氨酸對潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜通透性的影響[J].中華內(nèi)科雜志,2014，53(4): 308-9.

[31]Liu X C, Mei Q, Huang J, et al. Effect of homocysteine on the intestinal mucosal permeability in UC patients[J].ChinJInternMed, 2014, 53(4): 308-9.

Effect of homocysteine on the intestinal permeability by regulating MEK-ERK-MLCK signal transduction in experimental colitis rats

DING Shao-zhen, DING Hao, MEI Qiao, LIU Xiao-chang, HU Jing, HU Yong-mei, XU Jian-ming

(DeptofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,theKeyLaboratoryofDigestiveDiseasesofAnhuiProvince,Hefei230022,China)

Key words:homocysteine; inflammatory bowel disease; permeability; tight junction; myosin light chain kinase; extracellular regulated protein kinase

Abstract:AimTo investigate whether Hcy influenced the intestinal mucosal permeability by regulating MEK-ERK-MLCK pathway.MethodsSD rats were divided into 4 groups: normal group, normal+Hcy group, TNBS/ethanol group, TNBS/ethanol+Hcy group.Experimental colitis model with hyperhomocystinemia was established in rats with intracolonic administration of TNBS and subcutaneous injection of Hcy. The colonic mucosal tissue was collected for histopathological examination and activity of myeloperoxidase(MPO). The protein expression of MLCK, p-MLCK, MEK, ERK and p-ERK in intestinal mucosal tissues was examined by Western blot method. The mRNA expression of MLCK was examined by RT-qPCR method.ResultCompared with the normal group and TNBS group, the DAI and HI scores and the MPO activity were increased in TNBS/ethanol+Hcy group(P<0.01). Western blot and RT-qPCR showed that expression of MLCK, p-MLCK, MEK, ERK and p-ERK increased in small intestine in TNBS/ethanol+Hcy group. ConclusionHcy can increase intestinal permeability in TNBS-induced colitis rats by regulating the expression of MEK-ERK-MLCK signal pathway.

收稿日期:2015-11-30修回日期：2016-02-08

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81470809)；楊森科學研究委員會中國分會研究基金(No 2012JRCC 消化 02)

作者簡介：丁少楨(1991-)，男，碩士，研究方向：炎癥性腸病，E-mail:magthoridon@sina.com; 梅俏(1971-)，男，博士，副教授，研究方向:炎癥性腸病，通訊作者，E-mail:meiqiao@hotmail.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.012

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0498-05

中國圖書分類號：R-322; R322.45；R345.57；R574.62；R977.3；R977.4

網(wǎng)絡出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.024.html