張嬋娟，　趙佳儀，　黃翠芹，　李　勤，　王　珍，　甘丹卉，　朱麗紅，　陸大祥△

(1暨南大學醫(yī)學院病理生理學系，國家中藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632；2安徽人口職業(yè)學院護理系，安徽 池州 247099)

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▲并列第1作者

葉黃素抑制叔丁基過氧化氫誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡*

張嬋娟1,2▲，趙佳儀1▲，黃翠芹1，李勤1，王珍1，甘丹卉1，朱麗紅1，陸大祥1△

(1暨南大學醫(yī)學院病理生理學系，國家中藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632；2安徽人口職業(yè)學院護理系，安徽 池州 247099)

[摘要]目的： 觀察葉黃素(lutein)對叔丁基過氧化氫(t-BHP)處理的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC-5細胞系)的保護效應并探討其作用機制。方法:用免疫熒光染色檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)特異性蛋白Brn-3和神經(jīng)微管結合蛋白MAP-2的表達來鑒定RGC-5 細胞；將RGC-5細胞隨機分為對照組、t-BHP處理組、t-BHP和lutein共同處理組、lutein處理組，培養(yǎng)24 h，MTT實驗檢測細胞活力；Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞術檢測細胞凋亡；免疫細胞化學技術檢測caspase-3蛋白的活化情況；Western blot檢測Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3、JNK和c-Jun蛋白的變化。結果： MTT實驗和流式細胞檢測結果顯示，lutein能提高t-BHP處理的RGC-5 細胞的活力，并降低t-BHP誘導的RGC-5 細胞凋亡；免疫熒光結果顯示lutein能抑制t-BHP誘導的caspase-3的活化；與對照組比較，t-BHP處理后RGC-5細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)(P<0.05)，Bax/Bcl-2比率升高，cleaved caspase-3表達上調(diào)(P<0.05)，JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平增加(P<0.05)，t-BHP的上述作用可被lutein部分逆轉。結論：Lutein能夠降低t-BHP誘導的RGC-5細胞凋亡，其機制與其上調(diào)Bcl-2的表達、抑制caspase-3的活化并降低JNK和c-Jun蛋白的磷酸化有關。

[關鍵詞]叔丁基過氧化氫； 葉黃素； RGC-5細胞系； 細胞凋亡

天然的葉黃素(lutein)是一種優(yōu)能抗氧化劑，同時還具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[1]；葉黃素還是視網(wǎng)膜黃斑的主要色素成份。研究證實葉黃素在對抗多種視覺疾病中發(fā)揮作用，如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)[2]、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity, RP)[3]、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)[4]和視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷[5]等，其研究多集中于對視網(wǎng)膜色素上皮細胞的保護方面[6-8]，神經(jīng)營養(yǎng)作用[1,9]、抗炎作用[6,10]、減少藍光和紫外線誘導的DNA損傷作用[11-12]以及減少細胞ROS含量[13]等有關。其對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)的保護作用雖有報道，但作用機制仍待進一步探討[14]。本文運用細胞培養(yǎng)及分子生物學技術，體外觀察葉黃素對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞系RGC-5細胞是否具有保護作用，并對其機制進行探討。

材料和方法

1細胞

RGC-5細胞系由上海復旦細胞庫提供，其表達視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性蛋白Brn-3和神經(jīng)微管結合蛋白MAP-2(microtubule-associated protein 2)。

2主要試劑

葉黃素和叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)購自上海阿拉丁試劑公司，DMEM/F12 試劑培養(yǎng)基購自HyClone，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自BI，胰蛋白酶和MTT購自Sigma，cleaved caspase-3 抗體、JNK抗體、c-Jun抗體、Bcl-2 抗體以及Bax抗體均購自Cell Signaling Technology，神經(jīng)微管結合蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)抗體購自Millipore，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性蛋白Brn-3抗體購自Santa Cruz，Trict標記山羊抗兔、Dilight488 標記驢抗山羊Ⅱ抗購自Earthox。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3主要方法

3.1RGC-5 細胞株培養(yǎng)和傳代常規(guī)消毒滅菌，用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細胞，當細胞生長融合達70%～80%時進行傳代，吸出原培養(yǎng)液，用PBS緩沖液漂洗細胞，去除細胞表面的培養(yǎng)基成分及衰老死亡的細胞碎片，然后吸出PBS加入適量的胰蛋白酶(消化液能覆蓋細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板底即可)，37 ℃消化，邊消化邊觀察細胞形態(tài)，約3 min 后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，見細胞變圓，細胞神經(jīng)纖維消失，輕輕晃動有細胞從培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板底部脫落時，立即滴加含血清的培養(yǎng)基終止消化，反復輕柔吹打后收集細胞懸液，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸單細胞懸液，計數(shù)，以密度4×107cells/L接種于新的培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

3.2RGC-5 細胞系鑒定將RGC-5 細胞以每孔2×104cells的密度接種于鋪有直徑為13 mm蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁，顯微鏡下觀察其狀態(tài)良好時，去上清，復溫 PBS 洗3次，每次5 min；復溫4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次10 min；封閉液常溫封閉1 h，棄封閉液；用抗體稀釋液稀釋至工作濃度的Ⅰ抗Brn-3(1∶100)和MAP-2(1∶100)，4 ℃ 濕盒分別孵育48 h和24 h，去除Ⅰ抗，PBS洗3次，每次10 min；用相應的熒光Ⅱ抗室溫孵育Brn-3(4 h)，MAP-2(1 h)，去除Ⅱ抗，滴加Hoechst 33342試劑，室溫10 min，PBS 洗3次，每次10 min；抗熒光封片劑封片后，Leica熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。

3.3實驗分組(1)對照(control)組:加入完全培養(yǎng)基;(2)t-BHP處理組：加入終濃度為15 μmol/L t-BHP作用RGC-5 細胞24 h；(3)t-BHP和lutein共同處理組：加入15 μmol/L t-BHP、同時加入20 μmol/L lutein共同作用RGC-5 細胞24 h；(4)lutein處理組：加入終濃度為20 μmol/L lutein單獨作用RGC-5 細胞24 h。

3.4MTT比色法檢測細胞活力將RGC-5細胞以每孔8×103cells的密度接種于96孔板中，待細胞生長12 h，用不同濃度t-BHP 與lutein對細胞處理，每組設6個復孔，24 h 后，用終濃度為5 g/L的MTT溶液與無血清DMEM/F12配置成含10% MTT的混合液，去除原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL MTT混合液(上述配液及加液過程需避光操作)后置培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4 h，棄上清，加入150 μL DMSO在預熱10 min 的Bio-Rad酶標儀570 nm 波長處測定各孔吸光度(A)值,評價細胞活力，實驗重復3次。

3.5Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞術檢測細胞凋亡將RGC-5 細胞以每孔3×105cells的密度接種于6孔板中培養(yǎng)12 h后換液分組加藥作用24 h，收集細胞，包括漂浮在培養(yǎng)基上的細胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS將EDTA洗去，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS重懸，分出200 μL正常細胞不染色；1 000 r/min離心5 min,棄上清，加入200 μL Binding Buffer重懸，混勻后，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，室溫避光孵育10 min染色，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer重懸，混勻后，加入5 μL PI染色，上機檢測各組細胞的凋亡率。實驗重復4次。

3.6免疫細胞化學染色將RGC-5細胞以每孔2×104cells的密度接種于鋪有直徑為13 mm蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)12 h，換液分組加藥，作用24 h，棄上清，用復溫PBS洗3次，每次5 min，后用復溫4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3次，每次10 min，然后用封閉液常溫封閉1 h，棄封閉液，加入用抗體稀釋液稀釋至工作濃度的Ⅰ抗cleaved caspase-3(1∶250)，4 ℃濕盒過夜，去除Ⅰ抗，PBS洗3次，每次10 min，相應熒光Ⅱ抗室溫孵育2 h，去除Ⅱ抗，滴加Hoechst 33342試劑，室溫10 min，PBS洗3次，每次10 min，抗熒光封片劑封片后，Leica熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。實驗重復3次。

3.7Western blot將RGC-5細胞以每孔5×105cells的密度接種于6 cm的皿中，12 h后，換液分組加藥，24 h后，棄去各組培養(yǎng)液, 每皿加入80 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min，每隔10 min用細胞刮刮1次細胞，使裂解液與細胞充分混勻，用EP管收集上述混合液，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清；用BCA定量試劑盒(碧云天)進行蛋白定量，加入相應的loading buffer后，100 ℃變性5 min，分裝后放入-80 ℃冰箱備用；取上述樣品，按每組40 μg上樣，以12%～15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其中濃縮膠60 V 30 min，分離膠120 V 60 min；濕轉法轉移至PVDF膜，250 mA 90 min，電轉結束后取出PVDF膜用PBST洗3次，每次5 min，5%脫脂奶粉室溫孵育PVDF膜2 h，PBST洗3次，每次10 min，根據(jù)Mark標志，切取目的條帶，目的條帶分別加入Bcl-2、Bax、cleaved caspae-3、JNK、p-JNK、c-Jun 和p-c-Jun抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜(超過16 h)，PBST洗3次，每次10 min，用相應的辣根過氧化物酶標記的兔Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min，最后在膜上滴加ECL發(fā)光液，使用凝膠成像儀成像，用Quantity one軟件對結果進行分析；β-actin或GAPDH作為內(nèi)參照。實驗重復3次。

4統(tǒng)計學處理

使用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準誤(mean±SEM) 表示，組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用 Turkey 法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1RGC-5細胞鑒定

尤其是在新醫(yī)改環(huán)境要求下，醫(yī)學裝備的全生命周期管理，未來還將與醫(yī)學技術評估相結合。因此，醫(yī)學裝備的先進性、合理性與經(jīng)濟學適用性、效益性原則等，都將密切關聯(lián)。何斌希望從眼下維保規(guī)范化效益的小切口入手，能為將來整個醫(yī)學技術評估工作的開展奠定良好的數(shù)據(jù)基礎。

采用免疫熒光實驗對體外培養(yǎng)的RGC-5細胞株進行鑒定，以觀察體外培養(yǎng)的RGC-5細胞表達RGCs特異性蛋白的情況。MAP-2為神經(jīng)微管結合蛋白，是神經(jīng)元的特異性標記物；Brn-3為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性標記蛋白。實驗取貼壁后生長狀態(tài)良好的RGC-5細胞進行MAP-2和Brn-3染色，用熒光顯微鏡進行觀察，結果顯示所有RGC-5細胞均表達MAP-2和Brn-3蛋白，表明此細胞株具有RGCs的部分特性，可用于體外實驗，見圖1。

Figure 1.Immunolocalization studies for Brn-3 and MAP-2 in RGC-5 cells.

圖1免疫熒光檢測RGC-5細胞系Brn-3和MAP-2蛋白的表達

2MTT結果

采用MTT實驗檢測不同濃度的t-BHP和lutein作用于RGC-5細胞24 h細胞活力的變化。結果顯示：隨著t-BHP濃度的升高，RGC-5細胞的活力逐漸下降，當t-BHP濃度為15 μmol/L時RGC-5活力為對照組的44.4%±1.6%(P<0.01)；在20 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著lutein濃度的升高，RGC-5細胞的活力有所增加，與對照組比差異無統(tǒng)計學意義，且在lutein濃度為20 μmol/L時，細胞活力最高；同時使用光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L的lutein 使t-BHP損傷的RGC-5細胞的形態(tài)恢復至接近正常組。根據(jù)以上結果，確定15 μmol/L t-BHP為損傷模型的濃度，20 μmol/L的lutein為藥物保護濃度，見圖2。

Figure 2.The effect of lutein on cell viability and morphology in RGC-5 cells exposed to t-BHP. A: RGC-5 cells were treated with t-BHP at various concentrations for 24 h and cell viability was examined by MTT assay; B: RGC-5 cells were treated with lutein at various concentrations for 24 h and cell viability was also detected by MTT assay; C: RGC-5 cells were treated with t-BHP (15 μmol/L) or/and lutein for 24 h and observed by microscope. Mean±SEM.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L.

圖2MTT法和光學顯微鏡觀察lutein對t-BHP誘導的RGC-5細胞損傷的影響

3Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測結果

圖3為AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果，其中Q1區(qū)為正常細胞，Q2區(qū)為早期凋亡的細胞，Q3區(qū)為晚期凋亡的細胞，Q4區(qū)為壞死細胞。結果顯示：模型組RGC-5的凋亡率為(36.3±2.1)%，對照組RGC-5的凋亡率為(10.4±0.3)%，lutein保護組RGC-5的凋亡率為(16.8±0.8)%，單獨lutein組RGC-5的凋亡率為(9.9±0.6)%，以上結果表明t-BHP 可誘導RGC-5凋亡與對照組比較其凋亡率增加約26%(P<0.01)，加入lutein后，模型組細胞凋亡率下降約10%(P<0.01)，提示lutein可以抑制t-BHP誘導的RGC-5細胞的凋亡，降低其凋亡率。

4免疫熒光染色結果

模型組RGC-5細胞cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加，表達cleaved caspase-3蛋白的細胞在所有存活細胞所占比例明顯高于正常組和單獨的藥物組，加入lutein后，模型組RGC-5細胞cleaved caspase-3蛋白表達有所減少，表達cleaved caspase-3蛋白的細胞占存活細胞的比例減少。以上結果提示：lutein可以減少t-BHP誘導的RGC-5細胞caspase-3蛋白的活化，見圖4。

Figure 3.The effects of lutein (20 μmol/L) on apoptosis in t-BHP (15 μmol/L)-induced RGC-5 cells detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vst-BHP.

圖3流式細胞術檢測RGC-5細胞凋亡率

Figure 4.Cleaved caspase-3 expression of RGC-5 cells by immunocytochemistry. Nuclear staining of RGC-5 cells by Hoechst 33342.

圖4免疫熒光法檢測各組RGC-5細胞caspase-3蛋白的活化情況

模型組凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例較對照組增加(P<0.05)，加入lutein后，Bax/Bcl-2下降與對照組接近；活化的凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3 (cleaved caspase-3)在模型組的表達增加，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同樣，加入lutein后，其表達降低，與模型組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn) lutein能夠降低模型組JNK和c-Jun的磷酸化水平，模型組JNK和c-Jun的磷酸化增加，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，加入lutein后，其磷酸化水平下降，與模型組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果表明lutein可以降低t-BHP誘導的RGC-5細胞促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例及凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活化，同時能降低與JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平，從而抑制t-BHP誘導的RGC-5細胞的凋亡，見圖5。

Figure 5.Effect of lutein on Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3, p-c-Jun and p-JNK protein expression in RGC-5 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vst-BHP.

圖5Western blot實驗檢測各組凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、p-JNK 和p-c-Jun的變化

討論

RGCs是視網(wǎng)膜神經(jīng)元的主要成員之一，也是各種眼科疾病侵襲的主要對象，而且RGCs一旦死亡便不可再生，對視覺的損害是不可逆轉的[15]。對RGCs保護的研究也有很多，但由于RGCs損傷的多樣性及機制的復雜性，目前為止仍未找到能夠有效對抗RGCs損傷的藥物和方法[16]。本課題組一直致力于研究中藥單體對神經(jīng)元的保護作用，前期實驗已證明一些中藥單體如人參皂苷Rg1、原花青素等能夠對抗氧化應激損傷導致的RGCs凋亡[17]，在此基礎上，我們將視角聚焦在眼內(nèi)含量高、對多種眼科疾病均有改善作用的一種中藥單體葉黃素上，研究發(fā)現(xiàn)其對多種眼科疾病均有一定的改善作用，但其對RGCs的保護作用以及作用機制的報道不多見[18-19]。因此我們的研究主要集中于lutein對RGCs的保護方面。視網(wǎng)膜的成分比較復雜，由多種神經(jīng)元組成，RGCs在視網(wǎng)膜各種神經(jīng)元中所占比例較少，純化較困難，而且純化后存活率也難以保證[20],所以我們選擇RGC-5細胞系作為RGCs體外實驗部分的研究載體，初步觀察lutein對RGCs的保護作用。

氧化應激損傷是RGCs損傷致凋亡的常見因素[21]，與線粒體途徑關系密切，其中Bcl家族蛋白是線粒體凋亡途徑的主要控制因子。本實驗通過體外培養(yǎng)RGC-5細胞系，并用t-BHP誘導RGC-5氧化損傷建立損傷模型[22]，觀察lutein對t-BHP誘導RGC-5損傷的影響。

首先進行現(xiàn)象的觀察，體外培養(yǎng)RGC-5細胞，觀察其形態(tài)及生長狀況，用免疫細胞化學技術鑒定RGC-5特異性蛋白Brn-3和神經(jīng)元特異性標記蛋白MAP-2的表達情況，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的RGC-5細胞二者均表達，此細胞株可用于后續(xù)實驗。用MTT法和光學顯微鏡觀察法確定用于造模的t-BHP的濃度和lutein的保護劑量；然后用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞技術檢測lutein對t-BHP誘導RGC-5凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)lutein能夠使t-BHP誘導的RGC-5細胞系的凋亡率下降10%左右，從而起到保護RGC-5的作用，與lutein在視覺中發(fā)揮抗氧化作用和抗凋亡作用一致[23]。

然后探討lutein對抗t-BHP 誘導RGC-5凋亡作用的機制。長期慢性氧化應激會造成細胞損傷，并激活應激敏感的信號通路，導致細胞凋亡的產(chǎn)生，絲裂原激活的蛋白激酶家族(MAPKs)成員對這一進程的發(fā)展起至關重要的作用[24]。MAPKs包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERKs)、c-Jun 氨基末端激酶(JNKs)/應激活化蛋白激酶、p38以及其它激酶，其中ERKs通路主要調(diào)控細胞增殖，JNKs和p38通路與細胞應激和細胞凋亡有關，同時caspase-3依賴的線粒體凋亡途徑與JNK的磷酸化密切相關[25]。Caspase-3的活化是凋亡過程的重要階段,本實驗顯示lutein能夠減少t-BHP誘導的RGC-5細胞表達cleaved caspase-3蛋白；用Western blot技術檢測凋亡相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)lutein能夠降低t-BHP 誘導的RGC-5細胞Bax/Bcl-2比例和cleaved caspase-3的表達從而抑制t-BHP 誘導的RGC-5細胞的凋亡，其機制可能是通過調(diào)控JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平實現(xiàn)，即lutein能夠降低t-BHP 誘導的RGC-5細胞JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平，從而抑制t-BHP誘導的RGC-5細胞凋亡。

本部分實驗結果表明RGC-5細胞系表達Brn-3蛋白和MAP-2蛋白，t-BHP誘導體外培養(yǎng)的RGC-5細胞發(fā)生氧化應激損傷，可能通過激活JNK信號通路，使其發(fā)生磷酸化，磷酸化的JNK通過影響B(tài)cl-2家族成員到線粒體的轉位，造成線粒體功能障礙和caspase-3的活化從而引起凋亡，而lutein能夠通過逆轉上述過程發(fā)揮其對RGC-5的保護作用，在防治以氧化應激損傷為靶點的視網(wǎng)膜疾病方面具有潛在的應用價值。

[參考文獻]

[1]Slattery ML, Lundgreen A, Wolff RK. Dietary influence on MAPK-signaling pathways and risk of colon and rectal cancer[J].Nutr Cancer, 2013,65(5):729-738.

[2]Fernandez-Robredo P, Sadaba LM, Salinas-Alaman A, et al. Effect of lutein and antioxidant supplementation on VEGF expression, MMP-2 activity, and ultrastructural alterations in apolipoprotein E-deficient mouse[J].Oxid Med Cell Longevity, 2013,2013:213505.

[3]Gong X, Rubin LP. Role of macular xanthophylls in prevention of common neovascular retinopathies: Retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy[J].Arch Biochemistry Biophys, 2015,572:40-48.

[4]Sasaki M, Ozawa Y, Kurihara T, et al. Neurodegenerative influence of oxidative stress in the retina of a murine model of diabetes[J].Diabetologia, 2010,53(5):971-979.

[5]Dilsiz N, Sahaboglu A, Yildiz MZ, et al. Protective effects of various antioxidants during ischemia-reperfusion in the rat retina[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2006,244(5):627-633.

[6]Bian Q, Gao S, Zhou J,et al. Lutein and zeaxanthin supplementation reduces photooxidative damage and modulates the expression of inflammation-related genes in retinal pigment epithelial cells[J].Free Radic Biol Med, 2012,53(6):1298-1307.

[7]Murthy RK, Ravi K, Balaiya S, et al. Lutein protects retinal pigment epithelium from cytotoxic oxidative stress[J].Cutan Ocul Toxicol, 2014,33(2):132-137.

[8]Kalariya NM, Ramana KV, Srivastava SK, et al. Carotenoid derived aldehydes-induced oxidative stress causes apoptotic cell death in human retinal pigment epithelial cells[J].Exp Eye Res, 2008,86(1):70-80.

[9]Kowluru RA, Menon B, Gierhart DL. Beneficial effect of zeaxanthin on retinal metabolic abnormalities in diabetic rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2008,49(4):1645-1651.

[10]Bian Q, Gao S, Zhou J,et al. Lutein and zeaxanthin supplementation reduces photooxidative damage and modulates the expression of inflammation-related genes in retinal pigment epithelial cells[J].Free Radic Biol Med, 2012,53(6):1298-1307.

[11]Sasaki M, Yuki K, Kurihara T, et al. Biological role of lutein in the light-induced retinal degeneration[J].J Nutr Biochem, 2012,23(5):423-429.

[12]Santocono M, Zurria M, Berrettini M, et al. Influence of astaxanthin, zeaxanthin and lutein on DNA damage and repair in UVA-irradiated cells[J].J Photochem Photobiol B, 2006,85(3):205-215.

[13]Miyake S, Kobayashi S, Tsubota K, et al. Phase II enzyme induction by a carotenoid, lutein, in a PC12D neuronal cell line[J].Biochem Biophys Res Commun, 2014,446(2):535-540.

[14]Li SY, Lo AC. Lutein protects RGC-5 cells against hypoxia and oxidative stress[J].Int J Mol Sci, 2010,11(5):2109-2117.

[15]You Y, Gupta VK, Li JC,et al. Optic neuropathies: characteristic features and mechanisms of retinal ganglion cell loss[J].Rev Neurosci, 2013,24(3):301-321.

[16]Zhong YS, Wang J, Liu WM,et al. Potassium ion channels in retinal ganglion cells (review)[J].Mol Med Rep, 2013,8(2):311-319.

[17]Wang H, Zhang C, Lu D, et al. Oligomeric proanthocyanidin protects retinal ganglion cells against oxidative stress-induced apoptosis[J].Neural Regene Res, 2013,8(25):2317-2326.

[18]Widomska J, Subczynski WK. Why has nature chosen lutein and zeaxanthin to protect the retina?[J].J Clin Exp Ophthalmol, 2014,5(1):326.

[19]Abdel-Aal el-SM, Akhtar H, Zaheer K,et al. Dietary sources of lutein and zeaxanthin carotenoids and their role in eye health[J].Nutrients, 2013,5(4):1169-1185.

[20]Romano C, Hicks D. Adult retinal neuronal cell culture[J].Prog Retin Eye Res, 2007,26(4):379-397.

[21]Zhou X, Liu R,Wu Z.Recent progress in research on oxidative stress in glaucoma[J]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi, 2014,50(8):634-637.

[22]Sousa C, Moita E, Valentao P, et al. Effects of colored and noncolored phenolics of echium plantagineum L. Bee pollen in Caco-2 cells under oxidative stress induced by tert-butyl hydroperoxide[J].J Agric Food Chem, 2015,63(7):2083-2091.

[23]Schweigert FJ, Reimann J. Micronutrients and their relevance for the eye-function of lutein, zeaxanthin and omega-3 fatty acids[J].Klin Monbl Augenheilkd, 2011,228(6):537-543.

[24]Yang P, Reece EA, Wang F, et al. Decoding the oxidative stress hypothesis in diabetic embryopathy through proapoptotic kinase signaling[J].Am J Obstet Gynecol, 2015,212(5):569-579.

[25]Xu Y, Wang D, Zhuang Z, et al. Hypericin-mediated photodynamic therapy induces apoptosis in K562 human leukemia cells through JNK pathway modulation[J]. Mol Med Rep，2015，12(5):6475-6482.

(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Lutein suppresses t-BHP-induced apoptosis in retinal ganglion cells

ZHANG Chan-juan1,2, ZHAO Jia-yi1, HUANG Cui-qin1, LI Qin1, WANG Zhen1, GAN Dan-hui1, ZHU Li-hong1, LU Da-xiang1

(1DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofNursing,AnhuiVocationalInstituteofPopulation,Chizhou247099,China.E-mail:ldx@jnu.edu.cn)

[KEY WORDS]Tert-butyl hydroperoxide; Lutein; RGC-5 cell line; Apoptosis

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effects of lutein on retinal ganglion cellsinvitro. METHODS: The effect of lutein on tert-butyl hydroperoxide (t-BHP)-treated retinal ganglion cells (RGC-5 cell line) was determined. The protein expression of Brn-3 and MAP-2 was examined by the method of immunocytochemistry to identify the RGC-5 cells. The RGC-5 cells were induced by a 24 h exposure of t-BHP, and the cell viability was examined by MTT assay. The apoptotic ratio of the RGC-5 cells after exposed to t-BHP or/ and lutein treatment was analyzed by flow cytometry assay with Annexin V-FITC /PI staining. The activation of caspase-3 was detected by immunocytochemistry and the protein levels of Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3, JNK and c-Jun were determined by Western blot. RESULTS: The RGC-5 cells expressed Brn-3 and MAP-2 proteins. Lutein treatment prevented t-BHP-induced RGC-5 cell apoptosis and increased the cell activity. Compared with control group, exposure of the RGC-5 cells to t-BHP decreased the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2, increased the Bax/Bcl-2 ratio, up-regulated the level of cleaved caspase-3, also promoted the phosphorylation of JNK and c-Jun. Lutein partly reversed the effects of t-BHP on the RGC-5 cells mentioned above. CONCLUSION: Lutein protects RGC-5 cells against t-BHP-induced apoptosis by up-regulating Bcl-2 expression and inhibiting caspase-3 activation through modulating the JNK signaling pathway.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1043- 08

[收稿日期]2016- 01- 15[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金項目]國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2011CB707501)；國家自然科學基金資助項目(No.81371442)；廣州市科技計劃項目重大專項(No.11BppZXaa2070006)

通訊作者△Tel： 020-85228071； E-mail: ldx@jnu.edu.cn

[中圖分類號]R329.21

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.014