賀立彩，　朱真鋒，　鄭倩倩，　陳　尚，　顧海華

(溫州醫(yī)科大學檢生學院，浙江 溫州 325035)

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ACTL8的表達與乳腺癌臨床病理特征及預后的關(guān)系*

賀立彩，朱真鋒，鄭倩倩，陳尚，顧海華△

(溫州醫(yī)科大學檢生學院，浙江 溫州 325035)

[摘要]目的： 探討肌動蛋白樣蛋白8(ACTL8)在乳腺癌中的表達及其與乳腺癌臨床病理特征及預后的關(guān)系。方法: 采用Western blot方法檢測人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A和5種乳腺癌細胞株中ACTL8蛋白的表達；采用免疫組織化學方法檢測6例乳腺癌標本及其對應的癌旁組織中ACTL8蛋白的表達；收集TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集，將488例乳腺標本納入,分析ACTL8的mRNA表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征及預后的關(guān)系。結(jié)果: ACTL8蛋白在乳腺癌細胞株T47D、BT474、HCC1954和SKBR3中表達顯著高于乳腺上皮細胞株MCF-10A；ACTL8蛋白在乳腺癌組織中的表達也顯著高于癌旁組織；ACTL8 mRNA表達與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。ACTL8 mRNA高表達的乳腺癌患者5年內(nèi)生存率低、預后差。結(jié)論: ACTL8在乳腺癌組織中高表達并與乳腺癌臨床病理特征及預后密切相關(guān)，提示ACTL8可作為判斷乳腺癌預后的標志物。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌； 肌動蛋白樣蛋白8； 臨床病理特征； 預后

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率正呈逐年上升勢頭。乳腺癌是女性中發(fā)病率最高的腫瘤，2013年共有180萬乳腺癌新發(fā)病例，46.4萬乳腺癌死亡病例[1]。中國乳腺癌每年新增病例占世界乳腺癌的12.2%，每年乳腺癌死亡病例占總死亡的9.6%[2]。因此深入研究乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的潛在治療靶點對預防乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移及改善患者預后具有非常重要的意義。

癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)是在腫瘤組織中特異性表達，而在除睪丸或胎盤以外的正常組織中幾乎不表達的抗原[3-4]。研究表明，一些CTA 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如肺腺癌中NY-ESO-1和 MAGE-A3 的表達與不良預后相關(guān)[5]；在膀胱癌中，腫瘤的浸潤程度越高，MAGE基因家族的表達量越高[6]；腫瘤的病理核分裂象越高，NY-ESO-1的表達越高[7]。肌動蛋白樣蛋白8(actin-like protein 8, ACTL8)是actin相關(guān)蛋白家族成員之一，主要參與actin的折疊以及紡錘體的形成，核分裂和染色體的形成。Yao等[8]發(fā)現(xiàn)ACTL8為CTA家族成員之一。查閱國內(nèi)外文獻有關(guān)ACTL8與腫瘤的發(fā)展及預后的相關(guān)研究較少，且ACTL8在乳腺癌中的表達及其與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預后的關(guān)系也尚不清楚。本研究通過檢測ACTL8在乳腺癌中的表達并分析其與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預后的關(guān)系，以期提供判斷乳腺癌預后的標志物。

材料和方法

1細胞

人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A及乳腺癌細胞株(T47D、BT474、SKBR3、HCC1954和MDA-MB231)均購自ATCC。

2病例收集

用于免疫組化的乳腺癌樣本來源于溫州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2015年3月～2015年6月的乳腺癌石蠟標本，患者均為女性。用于臨床病理特征及預后分析的病例樣本來源于TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集，此數(shù)據(jù)集共含593例組織標本，其中有105例標本的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及總生存時間信息不完善。因此我們納入分析標本488例，包括427例乳腺癌組織樣本和61例正常乳腺組織樣本。

3主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone；培養(yǎng)基DMEM、DMEM/F12、 MEM和RPMI-1640均購自Gibco；青霉素-鏈霉素(P/S)雙抗、HRP-鼠 II 抗和兔 II 抗購自碧云天生物技術(shù)公司；ACLT8多克隆抗體購自上海生工生物技術(shù)有限公司；tubulin鼠源單克隆抗體購自Sigma；即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒購自武漢博士德；DAB試劑盒購自中杉金橋。

4主要方法

4.1細胞培養(yǎng)MCF-10A的培養(yǎng)液是DMEM/F12+5% FBS+insulin 1.8 g/L +1% P/S+hydrocoritisone 3.2 g/L。HCC1954的培養(yǎng)液為RPMI-1640 +10% FBS+1% P/S。SKBR3、T47D、BT474的培養(yǎng)液為DMEM+10% FBS+1% P/S。MDA-MB231的培養(yǎng)液為MEM+5% FBS+insulin 1.8 g/L+1% P/S。按照以上配方，細胞置于37 ℃、5% CO2、95% O2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

4.2Western blot實驗收集各細胞，細胞裂解液提取總蛋白，行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將凝膠電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉PVDF膜1 h。分別加入相應的 I 抗，4 ℃搖床孵育過夜。第2天將膜用TBST洗3次，每次10 min。加入HRP標記的相應 II 抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。將PVDF膜置于ECL試劑中反應1～3 min，經(jīng)超靈敏化學發(fā)光成像分析儀(Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng))掃描得到目的條帶。

4.3免疫組織化學染色標本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。65 ℃拷片1 h，二甲苯脫蠟及梯度脫水后，用pH=6.0的檸檬酸緩沖液高壓修復5 min，PBS洗3次， 3%過氧化氫封閉8 min，PBS洗3次，5% BSA封閉20 min，抗ACLT8兔源多克隆抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，第2天PBS洗3次，后用鏈霉素標記的山羊抗兔 II 抗常溫孵育30 min，PBS洗 3次，SABC增強劑常溫孵育30 min，PBS洗 3次，DAB試劑顯影5 min終止，蘇木素復染細胞核后脫水、封片。ACTL8存在于細胞漿中，出現(xiàn)棕黃色染色即為陽性。顯微鏡下隨機取10個高倍視野拍照并進行結(jié)果判定。

5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組計量資料間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，采用2檢驗分析ACTL8的表達與臨床變量關(guān)系，采用log-rank檢驗分析ACTL8的表達與總生存期關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1ACTL8蛋白在乳腺癌細胞株中和乳腺癌組織中的表達

為了研究ACTL8蛋白在乳腺癌中的表達情況，我們選擇1種正常的乳腺上皮細胞株和5種乳腺癌細胞株。結(jié)果顯示，正常乳腺上皮細胞株MCF-10A基本無ACTL8蛋白的表達，而乳腺癌細胞T47D、BT474、SKBR3和HCC1954中的ACTL8蛋白顯著表達,見圖1。

Figure 1.The expression of ACTL8 in the normal epithelial cell line and breast cancer cell lines tested by Western blot. β-tubulin was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMCF-10A group.

圖1Western blot檢測正常乳腺上皮細胞株及乳腺癌細胞株中ACTL8蛋白的表達

為了驗證ACTL8蛋白在臨床腫瘤樣本中的表達量是否和細胞株水平上結(jié)果一致，我們收集了6例乳腺癌石蠟標本及其對應的癌旁組織標本進行免疫組織化學染色。結(jié)果顯示，在6例乳腺癌組織樣本的細胞胞漿中均可見到ACTL8陽性染色，呈棕黃色，而在癌旁組織的細胞胞漿中未見到明顯的陽性染色，見圖2。這表明ACTL8蛋白在乳腺癌組織中的表達量明顯高于癌旁乳腺導管上皮細胞，該結(jié)果與乳腺癌細胞株的蛋白表達結(jié)果一致。

2ACTL8的mRNA表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

由于ACTL8蛋白在乳腺癌細胞中的表達顯著高于正常上皮細胞，這提示ACTL8的表達可能與臨床病理特征或預后有關(guān)。為了驗證這一點，我們收集了TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集，將488例標本納入分析，其中61例為正常乳腺組織標本，427例為乳腺癌組織樣本，分析了ACTL8的mRNA表達水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，ACTL8的mRNA在乳腺癌組織中的表達量顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)，見圖3。ACTL8的mRNA表達水平與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，即年齡越小(<65歲)、腫瘤直徑越大(≥2 cm)、TNM分期越晚(II+III+IV)、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移，ACTL8的mRNA陽性表達率越高,見表1。

Figure 2.The expression levels of ACTL8 between breast cancer specimens and corresponding adjacent breast tissues (immunohistochemical staining, ×200).A: negative expression of ACTL8 in adjacent breast tissue; B: positive expression of ACTL8 in breast cancer tissue.

圖2ACTL8 在乳腺癌組織中及對應癌旁組織中的表達

Figure 3.The mRNA expression levels of ACTL8 between the breast cancer tissues and the normal breast tissues. Mean±SD.*P<0.05vsnormal breast tissues.

圖3ACTL8 mRNA在乳腺癌樣本中及正常乳腺組織的表達

3ACTL8的mRNA表達與乳腺癌預后的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示，ACTL8的mRNA表達水平與乳腺癌患者術(shù)后生存期相關(guān)，高表達者總體生存率低。低表達和高表達的乳腺癌病人5年內(nèi)累計生存率分別為92.7%和78.6%，見圖4。

討論

乳腺癌是女性中發(fā)病率最高的腫瘤，發(fā)病率和死亡率正呈逐年上升勢頭，乳腺癌患者也呈現(xiàn)年輕化趨勢。尋找新的預后標志物對預防乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移及改善患者預后具有非常重要的意義[9-10]。

目前，已經(jīng)有153個CT-X基因被報道[11]，而且這些基因在不同的腫瘤細胞中的表達量不同，CT的表達量增高提示著疾病的進展以及不良的預后[12-13]?；贑T-X基因嚴格的表達及其與腫瘤免疫的關(guān)系，免疫疫苗的研究和應用受到重視，比如MAGEA和NY-ESO-1/CTAG1B疫苗已經(jīng)應用于臨床試驗，包括肺癌和黑色素瘤的病人[14-15]。ACTL4的單克隆抗體Ipilimumab已經(jīng)應用于臨床多中心實驗研究階段，藥物的持續(xù)效應還有待于觀察研究[16]。ACTL8為CTA家族成員之一，其在腫瘤中的相關(guān)研究較少。Freitas等[17]通過對膠質(zhì)瘤病人的研究發(fā)現(xiàn)ACTL8、OIP5、XAGE3和CTCFL 4種CTA蛋白在惡性膠質(zhì)瘤中高表達，但ACTL8與病人生存期無關(guān)。由于該研究僅納入48例膠質(zhì)瘤病人，而又無ACTL8在其它腫瘤中的相關(guān)研究，因此ACTL8與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預后的關(guān)系尚不明確。

表1在427例乳腺癌樣本中ACTL8的mRNA表達量與臨床病理特征的關(guān)系

Table 1.The correlation between the mRNA expression of ACTL8 and the clinicopathological features in the 427 cases of breast cancer

Figure 4.Kaplan-Meier survival curves for the patients with breast cancer according to the mRNA expression of ACTL8, which was checked by the log-rank test (P<0.01).

圖4ACTL8 mRNA的表達量與生存期的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)ACTL8蛋白在乳腺癌細胞株中的表達量明顯高于正常的乳腺上皮細胞株，且此實驗結(jié)果在臨床乳腺癌樣本中得到驗證，即ACTL8蛋白在乳腺癌腫瘤樣本中的表達量顯著高于相應的癌旁組織。為了深入探討分析ACTL8與乳腺癌的臨床病理和預后的關(guān)系，本研究利用Oncomine中TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集的資料系統(tǒng)地分析了ACTL8 mRNA表達與乳腺癌臨床病理特征及預后的關(guān)系。結(jié)果顯示，ACTL8的mRNA表達與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且ACTL8的mRNA表達量越高，預后越差。這些結(jié)果提示ACTL8可作為判斷乳腺癌預后的標志物，對評估患者預后具有一定的指導意義。而ACTL8在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的功能分子機制還有待進一步深入研究。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

ACTL8 expression and its correlation with clinicopathological features and prognosis in breast cancer

HE Li-cai, ZHU Zhen-feng, ZHENG Qian-qian, CHEN Shang, GU Hai-hua

(SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:haihuagu@gmail.com)

[KEY WORDS]Breast cancer; Actin-like protein 8; Clinicopathological features; Prognosis

[ABSTRACT]AIM: To investigate the actin-like protein 8 (ACTL8) expression and its relationship with clinicopathological features and prognosis in breast cancer.METHODS: The expression of ACTL8 in human normal mammary epithelial cell line MCF-10A and 5 breast cancer cell lines was detected by Western blot. The expression of ACTL8 was also investigated by immunohistochemistry in 6 cases of breast cancer specimens with adjacent normal tissues. The data in 488 cases of breast specimens from TCGA dataset were downloaded, and the relationship between the mRNA expression of ACTL8 and the clinicopathological features and prognosis was analyzed.RESULTS: The expression of ACTL8 in 4 breast cancer cell lines was significantly higher than that in breast epithelial cell line MCF-10A.The level of the ACTL8 expression in breast tumors was significantly higher than that in the corresponding adjacent normal breast tissues. The mRNA expression of ACTL8 was correlated with age, tumor size, clinical TNM stage and lymph node metastasis of breast cancer patients (P<0.05). The high expression level of ACTL8 mRNA indicated a poor prognosis of breast cancer patients. CONCLUSION: ACTL8 protein is highly expressed in breast cancer specimens and is closely correlated with the clinicopathological features and prognosis, suggesting that ACTL8 is a prognostic marker for breast cancer or a potential new target for treatment of breast cancer.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1138- 05

[收稿日期]2016- 01- 22[修回日期] 2016- 03- 28

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81400125; No. 81372826)；浙江省自然科學基金資助項目(No. LQ13H080002)；教育部博士點新教師類資助項目(No. 20133321120003)

通訊作者△Tel: 0577-86699659； E-mail: haihuagu@gmail.com

[中圖分類號]R737.9; R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.030