林智穎,張　靜,黃天文,陳曉春

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，福建省神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福建 福州　350001)

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全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)元鈣通道藥理研究中的應(yīng)用

林智穎,張靜,黃天文,陳曉春

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，福建省神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福建 福州350001)

全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)是研究離子通道和藥物對離子通道影響的最重要的技術(shù)之一，但是由于其對實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高，對實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制備和實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)用溶液等條件均有嚴(yán)格要求等原因致使其在實(shí)際運(yùn)用中較為困難。本文報(bào)告了運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)元鈣通道藥理研究的一些經(jīng)驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物和試劑孕期(19±1) d清潔級的SD大鼠由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院動物中心提供，人參皂苷Rb1購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。nifedipine、BayK8644、glutamate等購自美國Sigma公司，溶液中的電解質(zhì)均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器MP-285微操縱儀(Burleigh, 美國)，CCD Evolution QEi (monochrome)(Media Cybernetics，加拿大)，EPC9 triple放大器、Patchmaster2.1數(shù)據(jù)采集分析軟件(Heka, 德國)，P-97電極拉制儀(Sutter Ins, 美國)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的混合培養(yǎng)參照Zhang等[1]的方法并稍加改進(jìn)。取d 7的細(xì)胞用于電生理記錄。

1.2.2電生理記錄電極內(nèi)液包括：80 mmol·L-1Cs-methanesulfonate, 20 mmol·L-1tetraethylammonium chloride(TEA-Cl), 1 mmol·L-1CaCl2, 5 mmol·L-1MgCl2, 11 mmol·L-1EGTA, 10 mmol·L-1HEPES, 10 mmol·L-1Na2ATP；用CsOH將pH調(diào)整至7.2～7.3，用蔗糖將滲透壓調(diào)至300 mOsm。 細(xì)胞外液包括：115 mmol·L-1choline-Cl, 25 mmol·L-1TEA-Cl, 5 mmol·L-14-aminopyridine(4-AP), 5 mmol·L-1BaCl2, 10 mmol·L-1glucose,10 mmol·L-1HEPES, 0.000 5 mmol·L-1tetrodotoxin(TTX)；用Tris將pH調(diào)整至7.2～7.3，用蔗糖將滲透壓調(diào)至300 mOsm。本實(shí)驗(yàn)記錄的是電壓門控的鈣通道鋇電流(voltage-gated calcium channel Ba2+current, IBa)，采用鉗制電壓設(shè)定在-50 mV，階梯式給予從-70 mV到+70 mV指令電壓的激活程序，從-60 mV去極化到0 mV的藥物作用程序。

1.2.3實(shí)驗(yàn)給藥及處理細(xì)胞外灌流使用改良的Y管給藥裝置[2-3]。形成全細(xì)胞記錄模式[4]后，開啟Y管給藥裝置，從細(xì)胞一側(cè)微灌流事先配制好的含所需藥物濃度的細(xì)胞外液，所有細(xì)胞均在細(xì)胞破膜后3～5 min記錄到的電流穩(wěn)定時才給藥。

2　結(jié)果

2.1適合膜片鉗記錄的原代培養(yǎng)神經(jīng)元以60 000 cells·mL-1的密度種植于培養(yǎng)皿中經(jīng)7 d培養(yǎng)后的神經(jīng)元，在相差顯微鏡下觀察有活力的神經(jīng)細(xì)胞一般具有形狀近似錐形或三角形、表面完整光滑、胞體均一明亮、周圍光暈明顯等特點(diǎn)。

2.2藥理研究的給藥系統(tǒng)Y管給藥裝置中Y管給藥尖端距離目標(biāo)細(xì)胞50～100 μm，藥液高于Y管口30～50 cm以便其有足夠的重力流出。實(shí)驗(yàn)中給藥尖端的位置以100 μmol·L-1谷氨酸作為參照，通過“Y-tube”灌流100 μmol·L-1谷氨酸誘導(dǎo)出一個快速的內(nèi)向電流及隨之的穩(wěn)態(tài)電流，洗脫后基本恢復(fù)至基線。

2.3電壓門控的鈣通道電流的記錄在本實(shí)驗(yàn)條件下，通過在細(xì)胞內(nèi)外液中分別加入特異性的抑制劑，電壓門控的鈉電流及鉀電流被阻斷；將鉗制電壓設(shè)定在-50 mV，階梯式給予指令電壓可記錄到一束內(nèi)向Ba2+電流。記錄到的內(nèi)向Ba2+電流對L-型通道特異性的抑制劑硝苯地平和L-型通道激動劑BayK8644反應(yīng)靈敏。

2.4藥物對電壓門控的鈣通道的影響細(xì)胞外灌流20 μmol·L-1人參皂苷Rb1，IBa2+峰電流密度值(pA/pF)分別比給藥前降低(23±3.49)%(n=3,P>0.05)。Rb1對鈣電流的阻斷是可逆的，在洗脫后幾乎回復(fù)到基線。加入20 μmol·L-1人參皂苷Rb1后，最大的電流峰值由加藥前的(721.60±53.63) pA減少至(556.00±50.70) pA。Rb1明顯減少神經(jīng)細(xì)胞的IBa2+峰值(P<0.01,n=3)。同時Rb1對VGCC激活電位及反轉(zhuǎn)電位均無明顯影響。

3　討論

神經(jīng)細(xì)胞的制備、細(xì)胞封接和破膜、給藥系統(tǒng)的配置等諸多環(huán)節(jié)均可影響膜片鉗實(shí)驗(yàn)的成敗。我們先前的實(shí)踐證實(shí)在本培養(yǎng)系統(tǒng)下，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元既保留了鈣通道的電生理特性[5]，又克服了急性分離后狀態(tài)好的細(xì)胞數(shù)量有限、細(xì)胞狀態(tài)難以長時間保持等缺點(diǎn)；細(xì)胞在破膜記錄到穩(wěn)定電流后仍能保持較好的狀態(tài)，有利于藥物干預(yù)后較長時間的觀察。

Y管給藥裝置可自制，材料價格低廉，易于安裝。Y管給藥使我們能迅速準(zhǔn)確地觀察到通道對藥物的反應(yīng)以及其隨時間變化的趨勢，也實(shí)現(xiàn)了在同一細(xì)胞上序貫給予多種藥物干預(yù)的可能；使?fàn)顟B(tài)好的細(xì)胞得到了更高效地利用[2-3]。我們記錄了20 μmol·L-1Rb1對VGCC的影響以及電流在藥物作用前后隨時間的變化，在此基礎(chǔ)上通過對電流-電壓關(guān)系曲線圖的分析可以了解Rb1對VGCC激活電位、最大激活電位及反轉(zhuǎn)電位的影響；或者藥物對穩(wěn)態(tài)激活曲線和穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響[6]；從而客觀分析藥物對通道功能狀態(tài)的影響。

(致謝：感謝浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部段樹民教授給予的技術(shù)指導(dǎo)！)

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Application of whole cell patch clamp technique in pharmacological study of calcium channels in neurons

LIN Zhi-ying, ZHANG Jing, HUANG Tian-wen, CHEN Xiao-chun

(FujianInstituteofGeriatrics,theAffiliatedUnionHospitalofFujianMedicalUniversity;ResearchCenterofNeurobiology,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)；海馬神經(jīng)元；電壓門控的鈣通道；人參皂苷Rb1；原代培養(yǎng)；Y管

whole cell patch clamp; hippocampal neuron; voltage-gated calcium channels; ginsenoside Rb1；primary culture; Y-tube

2016-04-24,

2016-05-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30772555)；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2013J01311)；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(No 2012-CX-15)；福建省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No wzkf201309)

林智穎(1972-)，男，博士，副教授，研究方向：老年性癡呆基礎(chǔ)和臨床，E-mail：lzy8426@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.028

A

1001-1978(2016)09-1327-02

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.056.html