馬 超 何 華 董亞冰 趙玲玲 趙恒軍 王楠婭

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

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肝細(xì)胞癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測陽性率與射頻消融治療后短期療效的相關(guān)性

馬 超 何 華 董亞冰 趙玲玲 趙恒軍 王楠婭

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

目的 探討肝細(xì)胞癌(HCC)患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的檢出率與其他血清腫瘤標(biāo)志物及射頻消融治療后短期療效的相關(guān)性。方法 選擇37例HCC并進(jìn)行射頻消融治療的患者，術(shù)前均進(jìn)行CTC檢測，并搜集患者臨床特征、血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)的水平。術(shù)后1、3個(gè)月分別進(jìn)行肝臟增強(qiáng)CT/MRI的檢查，依據(jù)mRECIST標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)患者的短期療效，并應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)術(shù)前外周血CTC的檢出率及其與AFP、AFP-L3腫瘤標(biāo)志物水平、射頻消融治療后短期療效的關(guān)系。結(jié)果 術(shù)前CTC陽性患者為8例(21.6%)。其中巴塞羅那(BCLC)分期為0～A期20例，CTC檢測陽性者7例(35%)，BCLC分期為B～C期17例，CTC檢測陽性者1例(5.9%)，不同BCLC分期患者CTC陽性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.048)。經(jīng)過射頻消融治療后，21例在1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)進(jìn)行療效評價(jià)達(dá)完全緩解(CR)，16例為部分緩解(PR)或在3個(gè)月內(nèi)疾病進(jìn)展。3個(gè)月內(nèi)復(fù)查達(dá)到CR的21例有3例(14.3%)CTC檢測陽性。療后達(dá)PR或3個(gè)月內(nèi)進(jìn)展的16例中5例(31.3%)CTC陽性。兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.254)。8例CTC陽性的患者中有1例AFP>400 ng/ml、5例AFP-L3>1；CTC陰性的29例患者中有8例表現(xiàn)為AFP>400 ng/ml、4例表現(xiàn)為AFP-L3>1，兩組AFP水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.649)、AFP-L3水平有明顯差異(P=0.012)。結(jié)論 初診為中晚期HCC患者的CTC檢測陽性率無顯著提高，隨AFP-L3水平升高CTC陽性率增高，但對于AFP而言該趨勢不明顯。

肝細(xì)胞癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；射頻消融

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是指存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶脫落而進(jìn)入外周血液中，大部分CTC在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著于相應(yīng)的器官最終發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，從而增加惡性腫瘤患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)〔1〕。CTC的檢測可以用于預(yù)測某些實(shí)體腫瘤的預(yù)后及指導(dǎo)治療。但是，肝細(xì)胞癌(HCC)患者血清CTC的檢出率、CTC的水平與治療或預(yù)后的關(guān)系仍不明確。本研究將以此為研究重點(diǎn)，為尋找對HCC有預(yù)測、預(yù)后價(jià)值的生物標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2012年9月至2013年3月期間在我院腫瘤內(nèi)科經(jīng)影像學(xué)及病理活檢確診為HCC患者37例，男31例，女6例。年齡36～77(中位53)歲。HCC病理學(xué)診斷依照 WHO 腫瘤分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)，分期根據(jù)巴塞羅那(BCLC)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行0期2例，A期18例，B期10例，C期7例。甲胎蛋白(AFP)≥400 ng/ml 9例；甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)>1 28例；伴發(fā)病毒性乙型肝炎者31例；伴發(fā)病毒性丙型肝炎者6例。

1.2 外周血標(biāo)本的預(yù)處理 CellSearch系統(tǒng)由CellTracks AutoPrep、CellTracks AnalyzerⅡ分析儀以及CellSave儲(chǔ)存管、試劑盒組成。CellSave專用收集管采集患者外周血液，標(biāo)記批量處理中每個(gè)患者樣本的15 ml錐形管，倒置5次，混合批次中所有CellSave儲(chǔ)存管，從每個(gè)CellSave儲(chǔ)存管向相應(yīng)標(biāo)記的錐形管中倒入7.5 ml血液，向每個(gè)錐形管中加入6.5 ml稀釋緩沖液，蓋緊含有血液和稀釋液的錐形管，并倒置5次進(jìn)行混勻，離心10 min，樣本制備好后1 h內(nèi)在CellTracks AutoPrep系統(tǒng)上處理。采血后于室溫儲(chǔ)存并于96 h內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.3 CTC檢測操作步驟 CellSearch試劑盒包括上皮細(xì)胞黏附分子抗體(EpCAM)包被的免疫磁珠、細(xì)胞角蛋白(CK)及白細(xì)胞分化抗原45(CD45)的熒光抗體、細(xì)胞固定劑和緩沖液。標(biāo)本經(jīng)預(yù)處理后在CellTracks AutoPrep系統(tǒng)上進(jìn)一步采用含有免疫磁珠的試劑進(jìn)行孵育，通過納米磁珠捕獲靶細(xì)胞(即EpCAM陽性細(xì)胞)，細(xì)胞固定后分別加入藻紅蛋白標(biāo)記的CK8/18/19抗體，藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的CD45抗體，而后應(yīng)用熒光染料標(biāo)記結(jié)合的靶細(xì)胞。此后，經(jīng)上述處理的樣本注入樣本盒中，在MagNest裝置中，捕獲的細(xì)胞遷移至分析表面，在此由CellTracks AnalyzerⅡ分析儀的成像軟件進(jìn)行計(jì)算分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 治療前CTC檢測結(jié)果 8例(21.6%)治療前CTC檢測結(jié)果為陽性，其中，BCLC分期為0～A期20例中CTC檢測陽性者7例(35%)；B～C期17例中CTC檢測陽性者1例(5.9%)，不同BCLC分期的HCC患者CTC陽性率差異顯著(P=0.048)。

2.2 治療后短期內(nèi)療效與治療前CTC檢測結(jié)果分析 經(jīng)射頻消融治療后依據(jù)mRECIST標(biāo)準(zhǔn)對患者的病情進(jìn)行評估，有21例病情達(dá)到完全緩解(CR)，其中3例(14.3%)表現(xiàn)為治療CTC陽性。16例治療后病情表現(xiàn)為部分緩解(PR)或3個(gè)月內(nèi)進(jìn)展，其中5例(31.3%)為治療前CTC檢測陽性。兩組陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.254)。

2.3 CTC檢測結(jié)果與AFP、AFP-L3的相關(guān)性 在CTC陽性的8例患者中，有1例(12.5%)AFP>400 ng/ml、5例(62.5%)AFP-L3>1，CTC陰性的29例中8例(27.6%)的AFP>400 ng/ml、4例(13.8%)AFP-L3>1，兩組AFP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.649)、AFP-L3水平有明顯差異(P=0.012)。

3 討 論

對于腫瘤，早期診斷和治療是提高生存率的關(guān)鍵〔2，3〕。就HCC而言，常規(guī)的影像學(xué)檢查并不能發(fā)現(xiàn)微小浸潤性病變，亦不能對疾病做出準(zhǔn)確評判〔4〕。

郭柏棠〔5〕應(yīng)用CanPatrolTMCTCs技術(shù)對296例HCC患者進(jìn)行CTC檢測，結(jié)果顯示陽性率達(dá)71.43%，而且治療前CTC陽性患者無瘤生存期較CTC陰性患者明顯縮短，患者CTC水平與BCLC分期呈正相關(guān)。Kornelius等〔6〕應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)檢測了59例HCC患者CTC水平，30.5%的患者檢測到了CTC的存在，進(jìn)一步分析提示CTC陽性率與BCLC分期相關(guān)，即分期越晚陽性率越高，而且CTC陽性患者往往伴隨AFP水平的升高。Sun等〔7〕在一項(xiàng)研究中納入123例HCC患者，治療前CTC檢測陽性率為66.67%，研究以每7.5 ml血液中2個(gè)CTC為臨界值，結(jié)果顯示手術(shù)前CTC≥2個(gè)/7.5 ml血樣可作為疾病復(fù)發(fā)的預(yù)后指標(biāo)。

本研究部分結(jié)果與上述結(jié)果有偏差，如BCLC分期為0～A期的患者CTC檢測陽性率較B～C期患者高，且CTC 陽性與AFP水平無明顯相關(guān)性，可能系樣本量過少產(chǎn)生偏倚所致，但是綜合分析上述幾組研究結(jié)果可以看出CTC檢測對于HCC有一定預(yù)后意義，高的CTC檢出率與高的CTC水平往往伴隨不良的生存結(jié)局。CTC作為新的生物學(xué)標(biāo)志物值得進(jìn)一步深入研究，但當(dāng)今關(guān)于HCC患者CTC的相關(guān)研究以單中心、小樣本居多，應(yīng)當(dāng)積極進(jìn)行多中心、大樣本、前瞻性分析盡力探索CTC在HCC中的應(yīng)用價(jià)值〔8〕。AFP是目前HCC診斷及監(jiān)測復(fù)發(fā)最常用的指標(biāo)，但對于那些低AFP水平甚至AFP陰性的患者，CTC對于疾病復(fù)發(fā)的預(yù)測則更具優(yōu)勢〔9〕，而且AFP也并非預(yù)測HCC細(xì)胞播散的敏感指標(biāo)，例如在本研究中，部分患者CTC呈陽性，但是AFP卻處于正常水平；應(yīng)加快研究CTC在HCC療效評價(jià)中的作用，通過在臨床治療前進(jìn)行CTC檢測建立基數(shù)水平，在治療過程中監(jiān)測 CTC數(shù)目的變化從而明確治療效果及疾病進(jìn)展情況，從而使臨床醫(yī)生能更好地為患者制訂個(gè)性化治療方案，盡量避免醫(yī)療資源的浪費(fèi)〔10〕；另外，在精準(zhǔn)醫(yī)療逐漸到來的時(shí)代，可以通過CTC從分子生物學(xué)角度更好地反映疾病特征，或許在此過程中可以找尋到新的治療靶點(diǎn)，最終應(yīng)用于臨床造?；颊摺?1〕。

1 滕 飛，傅志仁.肝細(xì)胞肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究進(jìn)展及其在肝移植中的應(yīng)用前景〔J〕.中華移植雜志，2013；7(3)：29-33.

2 Forner A，Llovet IM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet，2012；379：1245-55.

3 Sherman M.Hepatocellular carcinoma：epidemiology，risk factors，and screening〔J〕.Semin Liver Dis，2005；25(2)：143-54.

4 Rodriguez-Peralvarez M，Luong TV，Andreana L，etal.A systematic review of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma：diagnostic and prognostic variability〔J〕.Ann Surg Oncol，2013;20(1)：325-39.

5 郭柏棠.肝細(xì)胞癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測與預(yù)后關(guān)系的初步研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2015：1-60.

6 Kornelius Schulze，Christin Gasch，Katharina Staufer，etal.Presence of EpCAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2013；133(9)：2165-71.

7 Sun YF，Xu Y，Yang XR，etal.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection〔J〕.Hepatology，2013；57(4)：1458-68.

8 龍建云，李 靜，黃 亮，等.肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展〔J〕.肝膽胰外科雜志，2016；28(1)：79-83.

9 Wong KF，Xu Z，Chen J，etal.Circulating markers for prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Exp Opin Med Diagn，2013；7(4)：319-29.

10 Liu MC，Shields PG，Warren RD，etal.Circulating tumor cells：a useful predictor of treatment efficacy in metastatic breast cancer〔J〕.J Clin Oncol，2009;27：5153-9.

11 Kelley RK，Magbanua MJM，Butler TM，etal.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma：a pilot study of detection，enumeration，and next-generation sequencing in cases and controls〔J〕.BMC Cancer,2015;15：206.

〔2015-12-31修回〕

(編輯 曹夢園)

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81201673)；吉林省教育廳課題資助(440030031191)；吉林大學(xué)優(yōu)秀青年教師培育計(jì)劃(419080500365)；吉林大學(xué)白求恩培育計(jì)劃(470110000488)

王楠婭(1980-)，女，副教授，主要從事肝癌研究。

馬 超(1989-)，男，碩士，主要從事惡性腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)20-5047-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.050