張 瑤, 張星慧，佘美華，尹衛(wèi)東,，楊 娟，Moshe Laudon，石金鳳

(1. 南華大學(xué)心血管疾病研究所，2. 南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，3. 衡陽愛爾眼科醫(yī)院,湖南 衡陽 421001；4.常德市第一人民醫(yī)院，湖南 常德 415003；5. Neurim Pharmaceuticals Ltd，以色列)

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Neu-P11對急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜AQP4表達(dá)及眼內(nèi)壓的影響

張 瑤2,4, 張星慧3，佘美華2，尹衛(wèi)東1,2，楊 娟2，Moshe Laudon5，石金鳳1

(1. 南華大學(xué)心血管疾病研究所，2. 南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，3. 衡陽愛爾眼科醫(yī)院,湖南 衡陽 421001；4.常德市第一人民醫(yī)院，湖南 常德 415003；5. Neurim Pharmaceuticals Ltd，以色列)

水通道蛋白4(aquaporin4, AQP4)是視網(wǎng)膜上重要的水通道蛋白之一，參與房水的分泌和排出，有調(diào)節(jié)眼內(nèi)水、電解質(zhì)運(yùn)輸平衡的功能[1]。褪黑素(melatonin, Mel)是松果體合成分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，可以作為黃斑變性、青光眼以及心血管疾病的一種輔助治療藥物，具有降低眼內(nèi)壓(intraocular pressure , IOP)的作用[2-3]。然而，褪黑素藥物化學(xué)合成提取相當(dāng)困難復(fù)雜，且又有半衰期短、個體差異大等不足。以色列研制出的Neu-P11，是能夠克服以上缺陷的新型褪黑素非選擇性受體激動劑，具有抗抑郁、抗氧化和鎮(zhèn)痛等作用，對糖尿病和高血壓等疾病有一定治療效果[4-5]，能降低正常新西蘭大白兔眼內(nèi)壓[6]。本文旨在研究Neu-P11對AQP4表達(dá)和高眼壓狀態(tài)下IOP的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 健康SD大鼠30只( 購自南華大學(xué)動物部，體質(zhì)量為200～250 g)。Mel/Neu-P11(Neurim Pharmaceuticals Ltd)； AQP4一抗(Cell Signaling Technology)。

1.2 高眼壓模型建立 采用Trendelenburg臥位 (頭低腳高80°位置)誘導(dǎo)急性高眼壓大鼠模型。每天8 ∶00～9 ∶00 am，動物被置于Trendelenburg臥位并監(jiān)測眼壓(測量20 min內(nèi)IOP，每 5 min測1次，共4次，取最大值)。眼角膜滴注固定體積(10 μL)藥物Mel/Neu-P11(100 μmol·L-1)局部治療，對側(cè)眼滴注相同體積生理鹽水進(jìn)行自身對照。給藥后，水平位置休息2 h，再次放置于Trendelenburg,臥位45 min后,置于平面，手持Tonopen XL眼壓計垂直于被測動物眼球連續(xù)測量6 h眼內(nèi)壓，重復(fù)實驗1周。

1.3 視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)檢查 過量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠后，迅速摘除整個實驗眼并標(biāo)記，立即放入眼球固定液(Carrnov25改良液)中固定24～36 h，脫水-透明-包埋-切片-烤干,常規(guī)HE染色。

1.4 免疫組化染色檢測視網(wǎng)膜中AQP4的表達(dá) 參照SP-9001工作方法，孵一至三抗，DAB顯色30～60 s后，用PBS終止顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸分色，常規(guī)梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 對所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組均數(shù)比較釆用One-way ANOVA，LSD檢驗進(jìn)行多個均數(shù)之間的兩兩比較。

2 結(jié)果

與正常對照組相比，Trendelenburg臥位處理后，模型組IOP上升了2.03倍(P<0.01)，建模成功。局部滴注Neu-P11/Mel治療1周的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3～6 h時降低IOP效果較好，尤其是在3 h，且在治療的d 4有最佳療效。通過比較眼內(nèi)壓均值結(jié)果顯示，與模型組相比，Neu-P11/Mel治療組IOP均有所降低(P<0.05)。高眼壓模型組視網(wǎng)膜增厚水腫，胞質(zhì)空亮，層次清晰欠佳，內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞間隙增大變厚， AQP4蛋白高表達(dá)。藥物Neu-P11/ Mel治療后，視網(wǎng)膜水腫等各方面得到了不同程度的改善， AQP4的陽性表達(dá)減弱。

3 討論

MT1、MT2和MT3是褪黑素主要的3類受體。MT1可抑制促心血管收縮相關(guān)激素分泌，MT2能調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和視網(wǎng)膜多巴胺的釋放，MT3可調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和眼內(nèi)壓。褪黑素調(diào)節(jié)眼壓平衡與其受體MT2和MT3相關(guān)[3]。Neu-P11為褪黑素非選擇性受體激動劑，與褪黑素有類似功能。本研究采用Trendelenburg臥位(頭低腳高80°位置)法成功建立急性高眼壓大鼠模型，結(jié)果模型組IOP升高為正常組的3倍以上，視網(wǎng)膜明顯增厚水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列混亂，各層AQP4高表達(dá)，呈強(qiáng)陽性。Neu-P11/Mel能明顯逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。提示，褪黑素及其受體激動劑Neu-P11能通過降低AQP4在視網(wǎng)膜的表達(dá)，調(diào)節(jié)眼內(nèi)水和電解質(zhì)的平衡，保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，降低眼內(nèi)壓。

(致謝:本實驗在南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室、南華大學(xué)心血管疾病研究所以及南華大學(xué)動物部完成。在此，對各位老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助表示誠摯的謝意。)

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Effects of Neu-P11 on retina AQP4 expression and IOP of acute high intraocular pressure rats

ZHANG Yao2,4, ZHANG Xing-hui3, SHE Mei-hua2, YIN Wei-dong1,2, YANG Juan2, Moshe Laudon5, SHI Jin-feng1

(1.InstituteofCardiovascularDiseases，UniversityofSouthChina, 2.DeptofBiotechnology，InstituteofPharmaceuticalandBiologicalSciences，UniversityofSouthChina, 3.AierEyeHospital，HengyangHunan421001，China; 4.theFirstPeople’sHospitalofChangde,ChangdeHunan415003，China; 5.NeurimPharmaceuticalsLtd，Israel)

Neu-P11; 褪黑素; 水通道蛋白4; 眼內(nèi)壓; SD大鼠; 特倫德倫伯臥位

Neu-P11; melatonin; AQP4; intraocular pressure; SD rat; Trendelenburg

2016-08-29,

2016-09-26

湖南省自然科學(xué)基金資助項目(No 14JJ2084);湖南省教育廳基金項目(No 15C1203);湖南省衛(wèi)生計生委基金(No C2015-19);衡陽市科技局基金(No 2014KS34)

張 瑤(1991-)，女，碩士生，研究方向：糖尿病的分子機(jī)制，E-mail：909878558@qq.com；

石金鳳(1977-)，女，實驗師，研究方向：糖尿病的分子機(jī)制，通訊作者，Tel：0734-8281388，E-mail：759843257@qq.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.056.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.028

A

1001-1978(2016)11-1624-02

R-332；R322.91；R347；R775；R977.6； R977.1