孟令旗，劉 暢，孫虎男，羅英花，臧延青，韓英浩，金成浩

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 1.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、2.動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、3.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

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醌茜素對人肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響及初步機(jī)制研究

孟令旗1，劉 暢1，孫虎男1，羅英花2，臧延青3，韓英浩1，金成浩1

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 1.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、2.動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、3.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

醌茜素是一種具有高效性、高選擇性和細(xì)胞能透性的藥物。雖然醌茜素能夠有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[1]，但醌茜素對肺癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。本文研究了醌茜素對人肺癌A549細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 3種人肺癌A549、NCI-H23、NCI-H460細(xì)胞株及正常肝QSG-7701細(xì)胞株(上海中科院細(xì)胞庫)；醌茜素(上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)；5-Fluorouracil(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)；RPMI 1640(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；MTT(美國Amresco公司)；DMSO(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；HRP標(biāo)記山羊抗兔、抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SanYo公司)；FACSCalibvr型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；電泳儀、半干轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-rad公司)；MicroChemi4.0型化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)(DNR公司)。

1.2 方法 采用MTT比色法檢測3種人肺癌A549、NCI-H23、NCI-H460及正常肝QSG-7701細(xì)胞的存活率，對照藥物為5-FU。采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測醌茜素處理A549細(xì)胞后凋亡情況。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期阻滯情況和細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量變化及細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路。

2 結(jié)果

2.1 醌茜素對人肺癌細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果顯示，不同濃度(0、1、3、10、30、100 μmol·L-1)的醌茜素均對人肺癌(A549、NCI-H460及NCI-H23)細(xì)胞的生長有抑制作用(P<0.01)，呈劑量依賴性，而且對正常肝QSG-7701細(xì)胞無明顯毒性作用，說明醌茜素對3種人肺癌細(xì)胞均具有明顯的增殖抑制作用。

2.2 醌茜素對人肺癌A549細(xì)胞周期的影響 結(jié)果顯示，用9.9 μmol·L-1醌茜素處理細(xì)胞0、3、6、12、24 h后，當(dāng)處理時間為24 h時，使A549細(xì)胞阻滯于G0/G1期。隨后，蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示，細(xì)胞周期G0/G1期相關(guān)蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E的表達(dá)量均逐漸減少，與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)，說明醌茜素通過調(diào)控人肺癌A549細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞G0/G1期的阻滯。

2.3 醌茜素對人肺癌A549細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果顯示，對照組(0 h)細(xì)胞生長貼壁較牢固，細(xì)胞膜邊界完整。隨著處理藥物時間(0、3、6、12、24 h)的延長，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞發(fā)生皺縮，變圓，出現(xiàn)類似細(xì)胞凋亡的特征。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著藥物處理時間的延長，Annexin V-FITC和PI的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，與陽性對照組(5-FU處理組)相比差異有顯著性(P<0.01)。

2.4 醌茜素對人肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 通過9.9 μmol·L-1醌茜素處理細(xì)胞0、3、6、12、24 h后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，死細(xì)胞比例未見明顯升高，而細(xì)胞早期凋亡及晚期凋亡的百分率隨著處理時間的增加出現(xiàn)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨后，蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示，p-Akt、p-p38、Bcl-2、procaspase-9及procaspase-3等蛋白的表達(dá)量逐漸減少，p-p53、Bad、cleaved caspase-3及cleaved PARP等蛋白的表達(dá)量逐漸增加(P<0.01)，說明醌茜素通過調(diào)控Akt、p38及p53信號通路誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 討論

肺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[2]。目前，臨床上的抗腫瘤藥物多數(shù)具有價格昂貴、毒副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)，因此，尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。醌茜素是一類蒽醌類化合物，對多種癌細(xì)胞均具有抑制增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)通過MTT比色法驗(yàn)證了醌茜素能夠抑制3種人肺癌細(xì)胞增殖[3]；通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot[4]實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了醌茜素通過調(diào)節(jié)G0/G1期周期蛋白的活性和表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制A549細(xì)胞的增殖，并能通過Akt、p38及p53蛋白信號通路誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在分子病理與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝對實(shí)驗(yàn)給予幫助的老師和同學(xué)！)

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Effects of quinalizarin on proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 cells and its possible mechanism

MENG Ling-qi1,LIU Chang1,SUN Hu-nan1,LUO Ying-hua2,ZANG Yan-qing3,HAN Ying-hao1,JIN Cheng-hao1

(1.CollegeofLifeScience&Technology, 2.CollegeofAnimalScience&VeterinaryMedicine, 3.CollegeofFoodScience&Technology,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,DaqingHeilongjiang163319,China)

醌茜素；人肺癌A549細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；信號通路

quinalizarin; human lung cancer A549 cells; cell proliferation; cell apoptosis; cell cycle; signaling pathway

2016-07-24,

2016-08-29

黑龍江省自然基金項(xiàng)目(No LC2015036)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No 201510223003)

孟令旗(1993-)，男，碩士生，研究方向：分子病理學(xué)與藥效學(xué)，E-mail：523336674@qq.com；

金成浩(1977-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子病理學(xué)與藥效學(xué)，通訊作者，Tel:0459-6819301,E-mail: jinchenghao3727@qq.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.058.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.029

A

1001-1978(2016)11-1625-02

R329.24；R329.25； R734.202.2；R979.1