季 華,王 征,范興麗,吳麗慧

(杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，浙江 杭州 310053)

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胸腺素β4對離體腦缺血模型神經(jīng)細胞凋亡和自噬的影響

季 華,王 征,范興麗,吳麗慧

(杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，浙江 杭州 310053)

胸腺素β4；氧糖剝奪/復(fù)供；凋亡；自噬；RT-qPCR；mRNA

缺血性腦血管病(腦缺血)是以腦循環(huán)血流量減少為特征的腦血管疾病，具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康。對于腦缺血防治藥物的研究至今尚無突破，尋找新型腦缺血防治藥物一直是國內(nèi)外研究熱點。腦缺血發(fā)生后，神經(jīng)細胞發(fā)生程序性死亡，包括凋亡和自噬(autophagy)[1]。近年來，自噬作用逐漸引起關(guān)注。

胸腺素β4(thymosin β4, Tβ4)是由43個氨基酸殘基組成的多肽，屬胸腺素β家族[2]，與新生血管發(fā)生、心肌修復(fù)等有關(guān)，作為促創(chuàng)傷愈合藥物被用于臨床[3]。近期多個研究提示Tβ4具有神經(jīng)保護作用，能減少星形孢菌素引起的運動神經(jīng)元死亡[4]，減輕興奮性氨基酸對皮質(zhì)神經(jīng)元和整體大鼠模型損傷[5]，改善腦缺血大鼠的神經(jīng)損傷癥狀[6]。最新研究認為Tβ4保護作用與促進少突膠質(zhì)細胞分化和髓鞘生成有關(guān)[7]，但Tβ4對神經(jīng)元凋亡和自噬作用仍不清楚。

氧糖剝奪/復(fù)供(oxygen-glucose deprivation and reperfusion，OGD/R)是體外模擬腦缺血的經(jīng)典模型，可在細胞水平評價藥物抗缺血損傷作用[8]。本研究擬采用該模型探討Tβ4對神經(jīng)細胞凋亡和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Tβ4購于美國Sigma公司；PC12細胞(pheochromocytoma cells)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細胞中心；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所,C1063)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit, 88953)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒(碧云天,S0107)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒(碧云天S0131)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(南京建成生物)；連二亞硫酸鈉(sodium dithionite, Na2S2O4)購于美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購于華東醫(yī)藥集團有限公司。

1.2 模型制備及分組 PC12細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，在對數(shù)生長期以每孔5×104個種板培養(yǎng)24 h，分組處理。造模細胞用含10 mmol·L-1Na2S2O4的無糖Earle’s液孵育4 h作為氧糖剝奪處理，然后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h作為復(fù)氧復(fù)糖處理。實驗分組：正常對照組、OGD/R模型組、OGD/R+Tβ4(0.1、1 、10 mg·L-1) 組。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 MTT檢測 取PC12細胞種板，分為5組：治療組(終濃度分別為0.1、1、10 mg·L-1Tβ4)、OGD/R損傷模型組、空白對照組。每孔加20 μL 5 g·L-1MTT，4 h后去上清，加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測吸光值(OD)，計算細胞存活率。

1.3.2 LDH檢測 細胞消化后種板，密度為1×108·L-1。損傷前，加入終濃度分別為0.1、1、10 mg·L-1Tβ4，設(shè)置為Tβ4干預(yù)組，同時建立OGD損傷模型組和空白對照組，試劑盒測定LDH活性。

1.3.3 SOD、MDA、GSH-Px檢測 取各組細胞上清液，按照SOD、MDA和GSH-Px檢測試劑盒說明書分別檢測并計算其含量。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測 設(shè)置對照組(PBS)、Na2S2O4處理給藥組(Tβ4濃度梯度0.1、1、10 mg·L-1)，對照組添加PBS，干預(yù)組給予不同濃度Tβ4處理6 h，各組OGD/R處理后，細胞懸液離心，按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 RT-qPCR檢測 提取細胞總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件進行引物設(shè)計，上海生物工程有限公司負責(zé)合成。Beclin1引物序列：上游5′-GGCAGTGGCGGCTCCTATTC-3′，下游5′-CTGTGAGGACACCCAAGCAAGAC-3′；Atg5引物序列：上游5′-TCAGCTCTGCCTTGGAACATCA-3′，下游5′-AAGTGAGCCTCAACTGCATCCTT-3′?；蛳鄬Ρ磉_水平以2(Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 Tβ4對OGD/R誘導(dǎo)細胞活力的影響 Tβ4和PC12細胞共同孵育24 h后，MTT結(jié)果分析表明，中、高濃度Tβ4干預(yù)組OGD/R損傷PC12細胞的存活率分別為(48.98±5.22)%、(51.05±12.32)%，均明顯高于OGD/R組(36.53±2.21)%。

2.2 Tβ4對OGD/R誘導(dǎo)細胞LDH的影響 在OGD/R損傷前后，中、高濃度Tβ4干預(yù)組LDH光密度差值分別為(0.84±0.01)、(0.71±0.01)，均低于OGD/R組(0.90±0.01)。2.3 Tβ4對OGD/R模型氧化應(yīng)激的影響 PC12細胞在OGD/R損傷后，與空白對照組比較，細胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性下降，MDA含量增高；經(jīng)中、高濃度Tβ4干預(yù)后，與OGD/R組比較，SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量下降，見Tab 1。

Tab 1 Effect of Tβ4 on oxidative stress

GroupSOD/kU·L-1MDA/μmol·L-1GSH-Px/kU·L-1Control0.54±0.041.43±0.0871.25±2.25OGD/R0.32±0.01**2.50±0.14**46.17±1.87**Tβ40.1mg·L-10.37±0.03**1.96±0.01**#48.98±1.94**Tβ41mg·L-10.41±0.03**#1.69±0.13**#54.62±2.01**#Tβ410mg·L-10.48±0.04#1.56±0.05#67.31±2.11#

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsOGD/R

2.4 Tβ4對OGD/R誘導(dǎo)細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測顯示，給予不同濃度Tβ4干預(yù)均明顯改善了OGD/R處理后細胞存活百分率[(26.85±0.61)%、(25.22±0.53)%、(24.75±0.50)%vs.(5.35±0.13)%]，降低了細胞晚期凋亡/壞死百分率[(6.35±0.34)%、(5.50±0.23)%、(12.11±1.35)%vs.(21.83±0.57)%]，并在高濃度Tβ4組中降低了細胞早期凋亡百分率[(58.65±0.94)%vs.(72.03±1.32)%]。

2.5 Tβ4對OGD/R誘導(dǎo)細胞自噬相關(guān)基因表達的影響 RT-qPCR檢測Beclin1和Atg5 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)與正常對照組[相對表達量(1±0.07)、(1±0.08)]相比，OGD/R損傷可使Beclin1和Atg5 mRNA的表達增加[(2.25±0.08)、(4.33±0.75)]；中、高濃度Tβ4干預(yù)組Beclin1和Atg5 mRNA的表達[中濃度Tβ4干預(yù)組(1.79±0.09)、(3.38±0.21),高濃度Tβ4干預(yù)組(2.00±0.26)、(3.30±0.59)]均明顯低于OGD/R組。

3 討論

腦組織對缺血缺氧均極為敏感，腦缺血一旦發(fā)生，腦內(nèi)能量將很快被耗竭，神經(jīng)細胞程序性死亡將很快發(fā)生[9]，繼而導(dǎo)致腦功能受損。已知自噬參與了腦缺氧缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，但對自噬在腦缺血中的作用卻有較大的爭議[10-11]。

本研究利用MTT檢測和流式細胞術(shù)均發(fā)現(xiàn)不同濃度Tβ4均能明顯減少細胞的壞死和凋亡，有效抑制OGD/R損傷后LDH的上升；抗氧化應(yīng)激損傷的研究顯示，Tβ4呈劑量依賴性提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，證實Tβ4有明顯OGD/R損傷后抗細胞凋亡的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)OGD/R損傷增加Beclin1和Atg5 mRNA表達，提示自噬水平的增加，而中、高濃度Tβ4干預(yù)可以明顯降低其mRNA表達，我們推測Tβ4保護作用可能與其抑制自噬水平過度升高有關(guān)，具體機制有待進一步研究來證實。

綜上所述，本研究從多個角度證明了Tβ4對于OGD/R損傷的PC12細胞有較好的保護作用，能抗氧化應(yīng)激損傷，抑制細胞凋亡，抑制損傷所致自噬水平升高，提示Tβ4可對腦內(nèi)神經(jīng)元有直接的保護作用，表明Tβ4對于腦缺血的治療有著廣闊的前景，可為Tβ4對腦缺血損傷的臨床前研究提供可靠依據(jù)。

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Thymosin β4 protects PC12 cells through inhibiting apoptosis and autophagy in vitro cerebral ischemia model

JI Hua，WANG Zheng，F(xiàn)AN Xing-li，WU Li-hui

(DeptofBasicMedicalSciences,HangzhouMedicalCollege，Hangzhou310053,China)

thymosin β4;oxygen-glucose deprivation and reperfusion;apoptosis;autophagy;RT-qPCR；mRNA

2016-07-25,

2016-08-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81271505);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃(No 2013KYA049);浙江省教育廳科研項目(No Y201226123)

季 華(1979-)，男，碩士，講師，研究方向：神經(jīng)發(fā)育障礙，Tel：0571-87692675，E-mail：jihua@hzm.edu.cn；

吳麗慧(1967-)，女，博士，教授，研究方向：神經(jīng)發(fā)育障礙疾病，通迅作者,E-mail：wlh@zjmc.net.cn

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.060.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.030

A

1001-1978(2016)11-1627-02

R329.24；R329.25；R743.310.22；R977.1