田志輝，倪曉辰，李　芳，殷鳳朝，馬永良，張愛莉

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腎透明細胞癌中DNMT1和HDAC1表達相關(guān)性研究

田志輝，倪曉辰，李芳，殷鳳朝，馬永良，張愛莉

[摘要]目的通過檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)和組蛋白去乙?；?(HDAC1)在腎透明細胞癌(RCCC)組織及癌旁組織中的蛋白表達情況，探討其與RCCC發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)行為相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)S-P法分別檢測114例RCCC組織、50例癌旁組織中DNMT1和HDAC1蛋白表達情況,并分析其表達水平與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果DNMT1蛋白在RCCC中的陽性率(71.93%)明顯高于癌旁組織(24.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HDAC1蛋白在RCCC中的陽性率(59.65%)高于癌旁組織(38.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DNMT1及HDAC1蛋白在RCCC中的表達與Fuhrman分級及臨床病理分期相關(guān)(P<0.01)，而與性別、年齡、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P>0.05)。相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示：DNMT1與HDAC1蛋白表達呈正相關(guān)(rspan=0.282，P=0.034)。結(jié)論DNMT1和HDAC1可能參與了RCCC的發(fā)生、發(fā)展，并有協(xié)同作用。

[關(guān)鍵詞]腎透明細胞癌；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1；組蛋白去乙酰化酶1；免疫組織化學(xué)

腎透明細胞癌(RCCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，普遍認為其發(fā)生是多步驟與多基因共同作用的結(jié)果，其中包括抑癌基因失活、癌基因過表達[1-4]。在調(diào)控基因表達過程中，RCCC發(fā)生與表觀遺傳學(xué)(包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA調(diào)控等修飾)關(guān)系密切。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)可以引起腫瘤細胞的生長抑制、凋亡增加伴有DNA甲基化改變，也是在體細胞中最豐富的甲基轉(zhuǎn)移酶。組蛋白去乙?；?(HDAC1)在多種腫瘤中過表達，對腫瘤的增殖和進展起到重要作用[5-11]。本實驗通過研究DNMT1和HDAC1在RCCC中的表達情況，揭示其在RCCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，以期為臨床靶向藥物的開發(fā)提供前瞻性研究。

1材料與方法

1.1標本來源隨機選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院泌尿外科2011年1月—2012年12月腎癌根治術(shù)后標本114例。術(shù)后標本及時置于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm的連續(xù)切片4張備用。所有標本均經(jīng)病理科診斷證實為RCCC，共114例，其中男66例，女48例，年齡21~82歲，平均年齡59.7歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，F(xiàn)uhrman分級1級26例，2級40例，3級36例，4級12例，臨床病理分期I期+Ⅱ期:76例，Ⅲ期+Ⅳ期:38例。所有患者術(shù)前均未行放、化療及生物免疫治療,且無其他腫瘤病史。同時取50例癌旁腎組織(距離大于腫瘤邊緣2 cm)作對照。

1.2主要實驗制劑DNMT1、HDAC1多克隆抗體(上海吉泰生物科技有限公司)，蘇木素、伊紅(上海生物工程科技有限公司)，SP免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3實驗方法采用鏈霉菌蛋白-過氧化物復(fù)合物(S-P)法，具體步驟按試劑盒說明書進行。每次染色均設(shè)陰性及陽性對照，選用已知陽性組織做陽性對照，陰性對照用PBS代替一抗。

1.4免疫組化結(jié)果判定DNMT1和HDAC1陽性染色部位為細胞質(zhì)或細胞核的棕黃色顆粒,采用雙盲法,隨機選擇10個高倍視野(400倍)，每個高倍視野下計數(shù)100個腫瘤細胞。觀察陽性細胞所占的百分數(shù)和染色強度。對陽性細胞所占百分比記分(標準為：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分)，染色強度(標準為：無色=0分，淡黃色=1分，棕黃色=2分，深棕色=3分)，兩者計分相加：0分為(-)，1~2分為(+)，3~4分為(++)，5~7分(+++)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性檢驗采用Spearman相關(guān)分析，α=0.05為檢驗水準。

2結(jié)果

2.1DNMT1及HDAC1蛋白在RCCC組織、癌旁組織中的表達DNMT1蛋白在RCCC組織、癌旁組織的陽性表達率分別為71.93%(82/114)、24.00%(12/50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.89，P<0.001)；HDAC1蛋白在RCCC組織、癌旁組織的陽性表達率分別為59.65%(68/114)、38.00%(19/50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.54，P=0.012)。其病理切片見圖1、2。

圖1　RCCC中DNMT1蛋白的表達(SP×200)圖2　RCCC中HDAC1蛋白的表達(SP×200)DNMT1為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1，HDAC1為組蛋白去乙?；?，RCCC為腎透明細胞癌

2.2DNMT1及HDAC1在RCCC中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系DNMT1、HDAC1在RCCC中表達與年齡、性別、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P>0.05)，與組織學(xué)分級及臨床病理分期相關(guān)(P<0.01)。見表1。

2.3DNMT1和HDAC1蛋白表達的關(guān)系RCCC標本中，DNMT1、HDAC1表達均陽性共56例,均陰性共20例。DNMT1陽性而HDAC1陰性26例,HDAC1陽性而DNMT1陰性12例，相關(guān)性檢驗結(jié)果：HDAC1及DNMT1在RCCC中的表達呈正相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)(rs=0.282，P=0.034)。

3討論

隨著遺傳學(xué)研究不斷深入發(fā)展,表觀遺傳學(xué)應(yīng)運而生,且表觀遺傳修飾與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[12-13]。表觀遺傳學(xué)包含4個步驟：DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體重塑和RNA相關(guān)沉默。研究發(fā)現(xiàn)，在一些人類基因組當(dāng)中，DNA甲基化水平總特征是局部高甲基化和廣泛低甲基化共存。而甲基轉(zhuǎn)移酶活性增加是所有轉(zhuǎn)化細胞的特征之一，甲基轉(zhuǎn)移酶活性增加能誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化。啟動子區(qū)DNA甲基化與組蛋白去乙酰化之間具有協(xié)同抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用，主要體現(xiàn)在：DNA過甲基化可能是基因轉(zhuǎn)錄抑制程序的直接啟動者，而過乙?；揎梽t是抑制程序的執(zhí)行者[5，14]。

DNMTs家族中主要有DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b四種蛋白，DNMT1可以引起腫瘤細胞的生長抑制、凋亡增加伴有DNA甲基化改變，也是在體細胞中最豐富的甲基轉(zhuǎn)移酶，被認為是主要的具有維持甲基化作用的酶[5]，研究發(fā)現(xiàn)DNMT1在多種惡性腫瘤中呈高表達：在肺癌中過高表達與患者較差的預(yù)后密切相關(guān)；在膀胱癌中高表達與組織分化明顯相關(guān)；在肝細胞癌中的高表達與其預(yù)后、惡性程度存在明顯相關(guān)[15-18]。DNA啟動子區(qū)異常甲基化總是伴隨著DNA甲基化酶1(DNMT1)的異常表達[19-20]。DNMT1的活性增加被認為是腫瘤發(fā)生的啟動事件[21]。

表1　DNMT1和HDAC1在RCCC中的表達及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

HDAC1是1996年由美國哈佛大學(xué)Taunton實驗室發(fā)現(xiàn)的第一個哺乳動物的HDAC，基因全長約41 kb，蛋白由482個氨基酸組成，相對分子量約55 kD[22]。目前已證實，HDAC1通過調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白的蛋白質(zhì)去乙?；瘏⑴c細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡調(diào)控，可能是哺乳動物基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子[23-25]。HDAC1的表達可能與多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌等的進展有關(guān)。HDAC1高表達明顯增加腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力，且其表達水平亦受調(diào)節(jié)細胞周期、分化和增殖的轉(zhuǎn)錄因子和高細胞密度的影響[23]。DNA甲基化異常引發(fā)的腫瘤中，HDAC1同樣也發(fā)揮著重要作用[26]。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測RCCC及癌旁組織中DNMT1、HDAC1的表達情況，結(jié)果顯示：DNMT1、HDAC1蛋白在RCCC中的陽性率明顯高于癌旁組織，提示兩者可能參與了RCCC的發(fā)生、發(fā)展。二者相關(guān)性檢驗結(jié)果提示兩者可能發(fā)揮了協(xié)同作用。

通過本項實驗結(jié)果，可預(yù)測DNMT1、HDAC1作為診斷RCCC的分子標記，但仍需進一步研究兩者在RCCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的分子機制，為臨床靶向藥物的開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

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(收稿時間：2015-09-21修回時間：2015-10-26)

·論著·

A Correlation Study between DNMT1 and HDAC1 Expression in Renal Clear Cell Carcinoma

TIAN Zhi-hui1a, NI Xiao-chen1b, LI Fang1c, YIN Feng-chao2, MA Yong-liang1b, ZHANG Ai-li1b(a. Department of Computer Tomography, b. Department of Urinary Surgery, c. Department of Pathology, the Fourth Hospital Affiliated to Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China; 2. Department of Urinary Surgery, the First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the DNA methylation transferase1 (DNMT1) and histone deacetyltransferase1 (HDAC1) expressions in tissues and peritumoral tissues of renal clear cell carcinoma (RCCC) so as to investigate the correlation between the expressions and pathogenesy, development and biological behavior in RCCC. MethodsImmunohistochemistry method was used to detect the DNMT1 and HDAC1 expression in 114 cases of RCCC tissues and 50 cases of peritumoral tissues, and then the correlation between the expressions and clinical pathologic characteristics was analyzed. ResultsThe positive rate of DNMT1 in RCCC tissues (71.93%) was significantly higher than 24.00% in the peritumoral tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). The positive rate of HDAC1 in RCCC tissues (59.65%) was higher than 38.00% in peritumoral tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). The DNMT1 and HDAC1 expressions were correlated with Fuhrman classification and clinical pathological stage (P<0.01), but the expressions was not related with the gender, age, tumor size and lymph node metastasis (P>0.05). The DNMT1 expression was positively correlated with HDAC1 expression (rspan=0.282， P=0.034). ConclusionThe DNMT1 and HDAC1 protein may participate in the pathogenesy and development of RCCC with synergistic effect.

[Key words]Renal clear cell carcinoma; DNA methylation transferase1; Histone deacetyltransferase1; Immunohistochemistry

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.013

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R737.11 R392.12A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0059-04

[通訊作者]張愛莉，E-mail:lifang198308@163.com

[基金項目][作者單位]050011石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院CT室(田志輝)，泌尿外科(倪曉辰、馬永良、張愛莉)，病理科(李芳)，石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科(殷鳳朝)