陳希，穆祥，許劍琴

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

抗菌中藥篩選思路的解析及實踐

陳希1，穆祥2*，許劍琴3*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

為研究防治細菌病的中藥方劑及有效成分，解析了抗菌中藥的篩選思路，提出了運用傳統(tǒng)中獸醫(yī)整體觀念、辨證論治的理論基礎(chǔ)進行中藥篩選。以治療動物李斯特菌病為例，根據(jù)小鼠動物模型(體內(nèi)模型)的臨床癥狀和中獸醫(yī)辨證論治理論，配伍組方篩選出鉤藤牛角地黃湯為治療方劑；結(jié)合李斯特菌的致病機理，以微血管內(nèi)皮細胞為基礎(chǔ)建立細胞損傷模型(體外模型)，進一步闡釋組方中各單味中藥及單一藥物成分的作用機理，即傳統(tǒng)中藥是通過改善、調(diào)節(jié)機體細胞功能緩解細胞損傷而非如抗生素一樣直接殺滅細菌。中獸藥創(chuàng)新研究務(wù)必在傳統(tǒng)中獸醫(yī)的理論指導(dǎo)下選擇藥物，利用中藥保護和調(diào)理微血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能，阻斷細菌毒素對微血管內(nèi)皮細胞的損傷作用，為中藥方劑及其有效成分治療細菌性疾病提供思路。

抗菌中藥；李斯特菌?。晃⒀軆?nèi)皮細胞

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中很早就有對傳染病的記載，《素問·遺篇·刺法論》言“五疫之至，皆相染易，無問大小、病狀相似”。“疫”即是傳染病，包括細菌性疾病。中(獸)醫(yī)在幾千年的臨床實踐中，為人畜健康起到了保駕護航的作用。利用中藥來治療傳染病，具有療效確實、應(yīng)用簡便等特點，并可從古人醫(yī)案中得以考證。在中醫(yī)理論基礎(chǔ)指導(dǎo)下運用中藥防治疾病具有藥物殘留少、毒性低、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點而被受世人關(guān)注，從中藥中尋求替代抗生素的藥物已成為世界性的研究熱點。

當前許多研究報道中常見的抗菌中藥篩選方法是通過體外抑菌試驗作為首要的判斷依據(jù)，但在研究中發(fā)現(xiàn)體外試驗與體內(nèi)試驗結(jié)果無法統(tǒng)一。這種只通過單純體外試驗篩選中藥方劑及有效成分的方法，脫離了中獸醫(yī)理論基礎(chǔ)指導(dǎo)，失去了中獸醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治的優(yōu)勢和特點。同時，就抗細菌性疾病中藥研究而言，體外抑菌試驗很難闡明中藥方劑作用機理，也很難篩選出具有較高療效的中藥方劑及其有效成分。因此，本文以中藥治療動物李斯特菌病為例，闡釋中獸藥治療動物細菌性疾病的組方思路以及抗菌中藥及其有效成分的篩選原則，為抗菌中藥的研發(fā)提供思路。

1 中藥防治細菌病的優(yōu)勢及問題

1.1 中藥防治細菌病的優(yōu)勢 中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)利用絕大部分來源于植物的中草藥防治疾病已有數(shù)千年的歷史，并積累了豐富的經(jīng)驗。因此，利用中藥替代抗生素的開發(fā)研究目前已成為世界性的熱點。中藥及方劑治療疾病的一個最大特點是從整體上、全方位改善機體的生理狀況。同時，中藥具有改善微血管內(nèi)皮細胞功能從而調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用。

隨著對微循環(huán)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)微循環(huán)在保持人和動物機體正常生理功能以及多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中顯示了重要的地位?，F(xiàn)已證明，微循環(huán)不單是循環(huán)系統(tǒng)的功能單位，而且是保證組織細胞結(jié)構(gòu)和執(zhí)行正常功能的重要微器官[1]，而微循環(huán)障礙是各種炎癥、感染、腫瘤、損傷等危重病共有的病理過程[2]，可進一步發(fā)展成為不可逆的全身彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)，直接威脅人和動物的生命。構(gòu)成微血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細胞，不但具有獨特的屏障功能，并能合成和釋放20多種細胞因子和炎癥介質(zhì)，進行各種信息的傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境的平衡，其在機體的凝血與抗凝、免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)調(diào)控等方面所起的重要作用已得到公認[3]。一旦內(nèi)皮細胞受損，必然會影響甚至破壞內(nèi)皮細胞正常的生物學(xué)功能，可增加通透性而失去屏障功能，同時還可產(chǎn)生較多的促栓物質(zhì)及減少抗凝物質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致局部及全身的微循環(huán)障礙，造成出血及血栓性疾病的發(fā)生。因此，臨床癥狀的產(chǎn)生與微血管內(nèi)皮細胞受損密切相關(guān)。

研究表明，利用中藥及其有效成分可以保護和改善微血管內(nèi)皮細胞功能，阻斷或減輕細菌毒素(溶血素、內(nèi)毒素、志賀毒素等)對微血管內(nèi)皮細胞的傷害[4-6]。中藥的有效成分可以抑制腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞因子和炎性介質(zhì)的過度釋放，調(diào)控微血管內(nèi)皮細胞的功能。中藥對血管內(nèi)皮細胞具有廣泛的作用，所以利用中藥保護和調(diào)理微血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能，阻斷多種細菌毒素對微血管內(nèi)皮細胞的損傷，為中藥防治細菌病開辟了新的思路。

1.2 針對中藥研發(fā)現(xiàn)狀需解決的問題

1.2.1 充分運用中獸醫(yī)學(xué)的整體觀念及辨證論治抗生素和目前抗菌中藥研發(fā)的共同思路是直接抑殺病原菌，即通過體外抑菌試驗篩選抗菌藥。直接抑殺病原菌的思路難以避免其固有的缺點：①病原菌和動物機體細胞在長期的共生過程中，在基因方面形成了廣泛的共性，因此，在抑殺病原菌的同時，難免傷害機體細胞和和體內(nèi)的正常菌群。這也是抗生素存在毒副作用的重要原因之一。②致病菌與非致病菌之間并無明顯的界限，已知的很多非致病菌在一定條件下可發(fā)生基因變型并表達各種致病因子(即毒素)而造成對機體的傷害。③有的中藥及其成分在體外的有明顯抑菌效果，但體內(nèi)抗菌療效很差；有的體外抑菌效果不明顯，但治療細菌病效果明顯。例如，胡乃寶[7]報道用地錦草、石榴皮煎劑和菖蒲注射液對動物腸炎、下痢有良好治療作用，但它們對大腸埃希菌體外均無抑菌作用；吳立夫等[8]用中草藥和抗生素進行的對比試驗表明中草藥體外試驗，幾乎沒有抑菌作用，但治療大腸埃希菌引起的仔豬黃白痢的效果很好。另一方面，某些中藥或其主要成分即使在體外有較好的抑菌效果，但在動物體內(nèi)遠遠達不到體外的抑菌濃度[9-10]。張濤等[11]研究表明多種中藥主要成分在組織液中檢測到的濃度遠遠低于其體外最小抑菌濃度，組織液中如此低的濃度值不可能起到抑殺病原微生物的作用。

中藥的“抑菌”作用不像抗生素那樣是直接作用于細菌而將其殺死。中藥若不在中醫(yī)的理論指導(dǎo)下應(yīng)用，運用這種方法篩選中藥就會導(dǎo)致中藥西化，最終失去了中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治的自身優(yōu)勢，顯然就不能稱之為中藥。對于抗細菌性疾病中藥的研究而言，體外抑菌試驗很難闡明中藥方劑作用機理，同時也很難篩選出具有較高療效的中藥及方劑。因此，應(yīng)在中獸醫(yī)的理論指導(dǎo)下，通過傳統(tǒng)中獸醫(yī)辨證論治，建立動物疾病證候模型，篩選出具有臨床效果的方劑，可避免中藥西化問題。

1.2.2 構(gòu)建中藥成分方劑 針對中藥方劑難于質(zhì)量認證和國際推廣問題的解決辦法，可通過構(gòu)建中藥成分方劑。因受中草藥采收季節(jié)、地域的限制，中草藥本身的質(zhì)量和有效成分相差懸殊，因而制成的產(chǎn)品難以進行準確的藥效評定和有效的質(zhì)量控制，致使中草藥的使用難免出現(xiàn)偏差，治療效果不穩(wěn)定，嚴重影響中藥的大規(guī)模臨床應(yīng)用。

根據(jù)臨床篩選出的中藥方劑，針對上述問題，選取方劑中單味中藥已知確定成分，分別觀察這些藥物活性成分對細胞損傷模型的調(diào)節(jié)作用，以此為依據(jù)篩選出方劑中的有效成分，最終構(gòu)建出中藥有效成分方劑。這就解決了中藥成分復(fù)雜，難以控制中藥質(zhì)量與國際接軌的問題。

2 以治療李斯特菌病為例的中藥篩選思路及實踐

2.1 李斯特菌病的防治現(xiàn)狀及存在問題

2.1.1 抗生素的應(yīng)用 抗生素治療是當今防治細菌性疾病包括李斯特菌病的主要措施。目前，治療李斯特菌病的方法是使用抗生素[12-14]，長期的抗生素治療已經(jīng)導(dǎo)致多種耐藥菌株的出現(xiàn)。據(jù)資料顯示，自1988年首次報道產(chǎn)單核細胞李斯特菌(L.monocytogenes，LM)的四環(huán)素耐受株以來，不斷從食品、環(huán)境及人李斯特菌病散發(fā)病例中分離到對一種或多種抗生素耐受的LM[15]。在李斯特菌病的常用藥物中，已先后發(fā)現(xiàn)對甲氧芐啶、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素等多種抗生素的耐藥性[13,16-17]耐藥菌株的感染導(dǎo)致治療困難，治療期延長，直接醫(yī)療負擔(dān)加重，病人/畜死亡率增加，對動物及人類健康構(gòu)成了威脅。李斯特菌病是一種新出現(xiàn)的食源性疾病，在過去10年間發(fā)生的多起暴發(fā)都與食物污染有關(guān)。耐藥性LM的出現(xiàn)給食品安全帶來了潛在危害，表現(xiàn)為食源性致病菌譜進一步復(fù)雜化，對應(yīng)的預(yù)防控制也更加困難。

此外，LM的耐藥基因有可能在各種食源性致病菌中傳遞，造成食源性致病菌普遍耐藥的局面，這無疑將會給食品安全管理、臨床治療帶來困難[15]。除了濫用抗生素導(dǎo)致的耐藥性問題以外，長期大量使用抗生素還造成藥物殘留，使畜產(chǎn)品質(zhì)量降低，阻礙了我國畜產(chǎn)品走入國際市場。另外，抗生素可能沉積到動物機體各重要的組織器官，造成機體免疫力下降，使得人和動物的慢性病增多，一些可以形成終生堅強免疫的疾病頻頻復(fù)發(fā)。

2.1.2 疫苗的應(yīng)用 由于LM的血清型較多，而且主要的免疫應(yīng)答是細胞免疫。因此，至今尚無有效的疫苗應(yīng)用于臨床。研究證明，缺失LLO表達基因的弱毒株并不能引起宿主免疫保護[17]。

2.1.3 產(chǎn)單核細胞李斯特菌的生物學(xué)特性及致病機理 產(chǎn)單核細胞李斯特菌/產(chǎn)單核細胞李氏桿菌/單核細胞增生李斯特菌(LM)是李氏桿菌屬的代表種，對人、家畜、家禽、野生動物均有侵襲力，能引起人和多種畜禽的李斯特菌病。亦可寄生在蜱、蠅、昆蟲、魚及甲殼動物體內(nèi)，存在于河水、污泥、屠宰場棄物、青貯料、奶及其制品中[18]。李氏桿菌分布甚廣，幾乎世界各地均有報道。LM具有13個血清型，其中最為常見的是4b和1/2a型[19]。

自然條件下，LM可使牛、羊、豬、禽等動物發(fā)病，引起急性敗血癥、孕畜流產(chǎn)、結(jié)膜炎、化膿性腦炎、肝、脾等器官呈現(xiàn)多發(fā)性壞死病灶和膿腫等病變。實驗動物中以家兔和小鼠對LM的易感性最強。目前已證實LM可感染40多種動物[20]。LM具有兼性胞內(nèi)寄生的生活特性，不僅能在巨噬細胞和單核細胞內(nèi)存活和繁殖，還能突破腸黏膜屏障、血胎屏障和血腦屏障，在肝細胞、內(nèi)皮細胞及成纖維細胞等多種細胞內(nèi)存活并繁殖。因此，LM被認為是最具感染力的細菌之一，其具有穿入細胞并在細胞內(nèi)增殖而不被吞噬細胞吞噬的特性。

LM細胞內(nèi)寄生依賴于主要毒力因子溶血素(listeriolysin, LLO)的分泌，感染通常開始于食用了LM污染的食物。通過淋巴循環(huán)和血液循環(huán)到達脾臟和肝臟，可通過血流從肝細胞到達大腦及胎盤[21-22]。在自然感染時，最主要的特征是入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤。

2.1.4 李斯特菌病與LLO誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān) LLO是LM的最主要毒力因子[23]，通過分泌LLO，LM可侵入多種宿主細胞，包括上皮細胞、肝實質(zhì)細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、甚至巨噬細胞。在自然感染時，最主要的特征是入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤。因此，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的LM必須通過與血管內(nèi)皮細胞作用穿過血腦屏障和胎盤屏障[24]。同時，微血管內(nèi)皮細胞沿血液流動的方向，不僅構(gòu)成了血腦屏障，也構(gòu)成了肝、腎等其它組織器官內(nèi)血液與組織間的主要屏障。因此，LM引起各組織器官的損傷首先要通過微血管內(nèi)皮細胞并與其發(fā)生作用，如傷害肝臟必須通過由微血管內(nèi)皮細胞組成的竇狀隙。目前，國外已有報道表示通過體外細胞試驗(人腦微血管內(nèi)皮細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞)證實了LM對血管內(nèi)皮細胞的刺激與損傷[25-26]。

2.2 治療李斯特菌病的中藥篩選

2.2.1 通過動物模型的建立進行中藥方劑篩選 以昆明小鼠為實驗動物，通過灌服LM途徑，感染小鼠出現(xiàn)皮膚發(fā)紅，有明顯出血斑；羞明流淚，睛生翳障，頭面部浮腫；站立不穩(wěn)，肢體麻木；項背強直，頭頸歪斜，圓圈運動等癥狀。可依據(jù)臨床癥狀和中獸醫(yī)衛(wèi)氣營血辨證理論，本病屬于熱邪入營血分證，即肝火上炎、肝陽化風(fēng)的表現(xiàn)?？梢郧鍩釠鲅?、清肝瀉火解毒、平肝熄風(fēng)為治則，從臨床治療李斯特菌病的13個中藥方劑中篩選出一個治療效果最佳的中藥方劑，即由犀角地黃湯加減形成的鉤藤牛角地黃湯(鉤藤、水牛角、丹皮、赤芍、生地組方)。

由中獸醫(yī)學(xué)理論可知，犀角地黃湯屬清營涼血方，具有清熱解毒、涼血散瘀功效，主治熱入血分之證。LM所致的小鼠動物模型辨證恰為熱毒熾盛于血分所致，其癥狀與本方治療范圍對應(yīng)。體溫升高、神經(jīng)癥狀可視為熱毒攻心，熱擾心神；皮膚出血斑、臟器充血、有壞死可判斷為該病熱邪迫血妄行，使血不循經(jīng)而致；肝開竅于目，羞明流淚說明該病可能是肝風(fēng)內(nèi)動、肝火上炎所致。治則以清熱解毒為基礎(chǔ)，配以涼血散瘀、平肝熄風(fēng)定驚為輔。

方用苦咸寒之犀角(水牛角代替)為君，涼血清心而解熱毒，使火平熱降，毒解血寧。臣以甘苦寒之生地，涼血滋陰生津，既能助水牛角清熱涼血，又能止血；還可補已失之陰血。用苦微寒之赤芍與辛苦微寒之丹皮共為佐藥，有清熱涼血，活血散瘀的作用，另加鉤藤為輔，平肝息風(fēng)、定驚。五藥相配，組成清熱解毒，涼血散瘀、平肝熄風(fēng)之劑。本方配伍特點是涼血與活血散瘀、平肝熄風(fēng)并用，使熱清血寧而無耗血動血之慮，涼血止血又無冰伏留瘀之弊，平肝而定驚，在實際應(yīng)用中效果理想。通過對體重，體溫、血象，死亡率，剖檢及病理組織學(xué)等指標的觀察，進一步確定了鉤藤牛角地黃湯治療小鼠李斯特菌病的作用效果[27]。

2.2.2 從微血管內(nèi)皮細胞角度闡釋中藥及其有效成分作用機理 研究表明，LM是通過其主要致病因子LLO作用于內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致細胞因子變化而產(chǎn)生致病作用[24]。李斯特菌病與微血管內(nèi)皮細胞受損而造成的微循環(huán)障礙有著密切的關(guān)系。因此，通過研究中藥方劑及其有效成分抗LLO致內(nèi)皮細胞傷害的機理，就可以篩選出能夠有效治療LM及其他細菌溶血素所致疾病的非抗生素藥物。

根據(jù)李斯特菌的致病機理，進一步以微血管內(nèi)皮細胞為基礎(chǔ)建立細胞模型，探討了李斯特菌主要毒力因子LLO對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞(RIMVECs)增殖活性及細胞因子(如NO、ET-1)分泌功能的影響，以及鉤藤牛角地黃湯及其主要成分(鉤藤堿、異鉤藤堿[28]、硫酸軟骨素[29]等)抗LLO致RIMVECs損傷的作用，旨在從調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細胞功能方面，揭示中藥治療李斯特菌病的作用機制。闡釋組方中各單味中藥以及單一成分對該菌造成的細胞損傷的作用機理，最終探尋該方劑所含有效成分并構(gòu)建中藥成分方劑。

3 抗菌中獸藥的研究思路

3.1 抗菌中藥與西藥的研究思路差異 利用中藥防治動物疾病的效果是確定無疑的，中藥防治細菌性疾病與抗生素及疫苗的作用有本質(zhì)的差別，主要體現(xiàn)在以下幾方面：①中藥對病原微生物的作用特異性較差，但作用面較廣，主要是通過提高動物機體防御機能實現(xiàn)防治疾病的目的；②絕大多數(shù)中藥不能直接作用于病原微生物，但當這些中藥及其主要成分被動物機體吸收后，可轉(zhuǎn)化為具有顯著抑菌作用的活性物質(zhì)，或刺激機體產(chǎn)生滅菌或抗菌物質(zhì)；③西方獸醫(yī)學(xué)在治療中側(cè)重于辨病，然后對病用藥，而祖國傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)在治療中側(cè)重于整體觀念，進行辨證論治。總之，中藥在防治動物疾病方面的特點主要體現(xiàn)在提高動物機體自身的抗病能力和提高機體非特異性免疫能力方面。

3.2 抗菌中藥的篩選原則 中獸藥創(chuàng)新研究務(wù)必在傳統(tǒng)中獸醫(yī)的理論指導(dǎo)下選擇藥物，單純的體外抑菌試驗無法解釋中藥作用機理，同時也很難篩選出具有較高療效的中藥及方劑。因此，我們應(yīng)通過傳統(tǒng)中獸醫(yī)辨證論治的方法，根據(jù)動物病理模型的證候，篩選出具有臨床效果的方劑，而后進一步對單味中藥及其有效成分進行篩選研究。

正如諾貝爾獎獲得者屠呦呦在題為《青蒿素的發(fā)現(xiàn)中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對世界的禮物》的演講中所說，“中國醫(yī)藥學(xué)是一個偉大寶庫，應(yīng)當努力發(fā)掘，加以提高。” 如何科學(xué)、合理的開發(fā)利用中藥，已經(jīng)成為當下的研究熱點。本文通過解析中藥方劑及其有效成分治療動物李斯特菌病的研究思路為中藥治療細菌病乃至其他疾病提供了一種新的研發(fā)思路，即以祖國傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治的觀念為指導(dǎo)原則，通過中藥改善微循環(huán)和保護微血管內(nèi)皮細胞角度防治細菌病，對中藥方劑的科學(xué)創(chuàng)新具有一定意義。

致謝：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所劉業(yè)兵處長從文章的選題、結(jié)構(gòu)的梳理、用詞表達的準確等各個方面都給予了很多幫助，在本文的寫作及修改中傾注了大量精力。同時，鞏忠福研究員在文章的寫作中提出了很多有意義的觀點和建議。作者在此表示衷心的感謝！

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(編輯：李文平)

Screening Approach of Antimicrobial Chinese Traditional Medicine and Practice

CHEN Xi1，MU Xiang2*, XU Jian-qin3*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)

In order to study the mechanism of the prevention of bacteriosis by Chinese traditional medicine, the holistic concept and syndrome differentiation in screening of antimicrobial Chinese herbs was emphasized. The therapeutic principle based on pathogenesis of listeriosis obtained through differentiation of symptoms and signs to the animal model using the theory of Chinese traditional medicine. According to the principle of removing pathogenic heat from blood and calming liver to quench endogenous wind, the best therapeutic efficacy named rhynchophylla cornus rhinoceri and rehmanniae decoction was chosen. The experiments were designed to observe the effects of the decoction and the main constituents on the proliferation and secretion of the microvascular endothelial cells(CMEC)invitroon basis of the establishment of CMEC injured model. Antimicrobial Chinese traditional medicine could relieve cell damage by regulating cell function. Therefore, the innovation research of Chinese traditional medicine must be chosen according to traditional theoretical direction. Protection and regulation of CMEC from the damage of bacterial toxins was a new screening approach of antimicrobial Chinese traditional medicine.

antimicrobial Chinese traditional medicine；listeriosis；microvascular endothelial cells

陳希，博士，從事中獸藥相關(guān)方面研究。

穆祥，E-mail: muxiang1109@sina.com；許劍琴，E-mail: jianqinxucau@126.com

2015-11-13

A

1002-1280 (2016) 02-0001-06

S853.74