謝立蘭，方六榮，方華為，張軍林，安康，肖少波*

(1.武漢生物工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究中心，武漢 430415；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在豬傳染性胃腸炎診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

謝立蘭1，方六榮2，方華為1，張軍林1，安康2，肖少波2*

(1.武漢生物工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究中心，武漢 430415；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

近年來(lái)，與豬傳染性胃腸炎(TGE)類似的腸道傳染病日益增多，以病理組織學(xué)觀察和臨床癥狀為主要指標(biāo)的傳統(tǒng)方法已不能進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，眾多學(xué)者建立了大量的免疫學(xué)和分子生物學(xué)新方法。文章就主要免疫學(xué)技術(shù)(病毒中和實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、膠體金技術(shù))和分子生物學(xué)技術(shù)(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基于納米顆粒和DNA探針技術(shù)的超靈敏PCR方法)在TGE診斷中的最新應(yīng)用研究進(jìn)行了綜述，以期為進(jìn)一步防控該病提供參考。

豬傳染性胃腸炎；免疫學(xué)技術(shù)；分子生物學(xué)技術(shù)；診斷

豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis, TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)引起的以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的傳染病，是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一[1]。該病由Doyle和Hutchings于1946年在美國(guó)首次報(bào)道，幾年之內(nèi)在世界各個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。為此，各國(guó)學(xué)者對(duì)TGE的診斷方法進(jìn)行了大量研究，并建立了病毒分離、熒光抗體技術(shù)、免疫電子顯微鏡技術(shù)、病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、核酸探針和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等大量方法[2]。近年來(lái)，該病在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，疫區(qū)也逐步擴(kuò)大，并與豬輪狀病毒病、豬流行性腹瀉混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)TGE的診斷特別是該病與其他腸道腹瀉病毒病的鑒別診斷方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，診斷方法主要集中于免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。本文就近年來(lái)診斷該病的免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 免疫學(xué)方法

1.1 病毒中和實(shí)驗(yàn) Carbery等人于1969年根據(jù)病毒與相應(yīng)的抗體結(jié)合后會(huì)失去對(duì)易感動(dòng)物或細(xì)胞的致病力的原理建立了病毒中和實(shí)驗(yàn)(virus neutralization, VN)，該方法以直觀性著稱，長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛用于多種病毒病的檢測(cè)。然而，一些研究表明用中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGEV抗體時(shí)，與豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratory coronavirus, PRCV)抗體存在交叉反應(yīng)，這可能是因?yàn)門GEV和PRCV的序列相似度較高，導(dǎo)致中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGEV的特異性不強(qiáng)。此外，Nelosn等[4]比較了VN實(shí)驗(yàn)與ELISA試驗(yàn)檢測(cè)TGEV抗體，當(dāng)用細(xì)胞培養(yǎng)或腸道分離的TGEV感染豬并對(duì)其血清進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ELISA檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果比VN 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果分別早3 d和1 d，表明病毒中和實(shí)驗(yàn)的敏感性不強(qiáng)[5]。綜上可見病毒中和實(shí)驗(yàn)在用于檢測(cè)TGEV時(shí)表現(xiàn)出了特異性差和敏感性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，因此限制了該方法在TGE診斷中的進(jìn)一步應(yīng)用。

1.2 ELISA試驗(yàn) ELISA試驗(yàn)較之以往的血清學(xué)方法(如：VN實(shí)驗(yàn))具有敏感性高、特異性強(qiáng)和可高通量檢測(cè)樣本等特點(diǎn)，是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法。周仲芳等于1997年率先以桿狀病毒表達(dá)的TGEV 纖突蛋白(S蛋白)建立了阻斷ELISA方法檢測(cè)TGEV[6]，并進(jìn)一步證實(shí)該方法可用于TGEV和PRCV的鑒別診斷[7]。Carmen等進(jìn)而運(yùn)用Svanova Biotech公司的TGEV/PRCV阻斷ELISA試劑盒檢測(cè)了大量樣本，證實(shí)阻斷ELISA方法用于TGEV的血清學(xué)檢測(cè)方法可靠、簡(jiǎn)便[8]，奠定了該方法為進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫中常用方法的重要地位。由于運(yùn)用純化的全病毒作為包被抗原建立的試劑盒[8]存在抗原獲得量低，純化困難等缺點(diǎn)，López等對(duì)鑒別TGEV/PRCV的阻斷ELISA方法進(jìn)行了優(yōu)化[9]。PRCV與TGEV的唯一區(qū)別在于PRCV的S基因中缺失B、C位點(diǎn)，根據(jù)該原理利用桿狀病毒表達(dá)S 蛋白建立的抗原捕獲阻斷ELISA方法檢測(cè)TGEV，通過(guò)對(duì)600 份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其檢測(cè)結(jié)果與單獨(dú)檢測(cè)TGEV和PRCV的已有商品話試劑盒100%吻合，對(duì)兩種病毒檢測(cè)的特異性分別達(dá)到100% 和92.06%[9]。近期，國(guó)內(nèi)學(xué)者尹杰等人則以表達(dá)、純化的TGEV S基因B、C抗原基因的重組蛋白作為診斷抗原建立了檢測(cè)TGEV抗體的間接ELISA方法，該間接ELISA方法特異性和重復(fù)性良好，敏感性比血清中和試驗(yàn)高，有望用于TGEV的保護(hù)性抗體水平檢測(cè)[10]。

由于已建立的阻斷ELISA 商品化診斷試劑盒價(jià)格昂貴，不適于我國(guó)臨床診斷的廣泛應(yīng)用[11]。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)TGEV的ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行了大量研究?；诓《镜鞍鬃鳛榘豢乖闹饕晒校核握褫x等應(yīng)用表達(dá)的重組TGEV衣殼蛋白(N蛋白)建立了間接ELISA方法[11]，通過(guò)對(duì)62 份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該方法與國(guó)外Svanova TGEV/PRCV試劑盒的符合率為93.5%。類似的，屈月[12]選用抗TGEV N蛋白的單抗和多抗血清建立雙抗體夾心ELISA方法，該方法具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，與其他豬病病毒反應(yīng)無(wú)交叉性。另外，牟春曉等以S基因主要抗原位點(diǎn)A和D為基礎(chǔ)建立了間接ELISA方法，該方法與純化的TGEV包被的間接ELISA的符合率也較好[13]。另一方面，考慮到當(dāng)前申報(bào)的TGEV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒均檢測(cè)血清中IgG抗體，而分泌性免疫球蛋白A (IgA)在腸道黏膜免疫起著重要作用，是腸道免疫中的主要抗體分子，且韓國(guó)已經(jīng)研制出了檢測(cè)乳汁PED-IgA抗體的ELISA試劑盒。我國(guó)的蔣鳳英[14]和閆貴偉[15]等分別以純化的TGEV和重組的N蛋白為抗原建立了豬母乳抗TGEV IgA抗體檢測(cè)方法，對(duì)TGEV陽(yáng)性乳汁樣品的最低檢測(cè)濃度分別為1∶320和1∶160，彌補(bǔ)了豬傳染性胃腸炎IgA抗體檢測(cè)空白，具有較好的應(yīng)用前景[15]。

1.3 膠體金技術(shù) 膠體金免疫技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)[16]。由于具有檢測(cè)時(shí)間短、試劑和樣本用量少等特點(diǎn)，膠體金免疫技術(shù)在生物學(xué)各領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[16]。暢丹[17]和屈月[12]先后采用檸檬酸三鈉法制備20 nm膠體金顆粒標(biāo)記抗TGEV N蛋白的單克隆抗體(McAb)，并分別以純化的抗TGEV N蛋白的多克隆抗體(PcAb)和羊抗鼠IgG作為檢測(cè)線和質(zhì)控線成功研制出了一種檢測(cè)TGEV的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條可檢測(cè)100 TCID50的TGEV病毒培養(yǎng)液，且4 ℃密封保存90 d后仍能有效檢測(cè)樣品，適合于基層推廣[17]。常亮等[18]通過(guò)優(yōu)化膠體金的稀釋液等措施對(duì)TGEV的膠體金快速檢測(cè)條進(jìn)行了改進(jìn)，優(yōu)化后的試紙條在常溫下可保存1 年，并可檢測(cè)出TGE病料中的TGEV，檢測(cè)結(jié)果與韓國(guó)的商品化試紙條一致，有望用于生產(chǎn)實(shí)際。

2 分子生物學(xué)診斷

2.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)

2.1.1 RT-PCR RT-PCR 技術(shù)是將病毒RNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR以檢測(cè)病毒的方法[2]。早在1997 年，Paton等[19]根據(jù)TGEV和PRCV的S基因設(shè)計(jì)引物，成功建立了檢測(cè)TGEV的最早的RT-PCR方法。李軍等首次在國(guó)內(nèi)對(duì)RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了可檢出1 pg TGEV RNA的RT-PCR方法，經(jīng)過(guò)對(duì)56 份豬腹瀉糞樣的檢測(cè)證實(shí)該方法準(zhǔn)確、可靠[20]。此后，一些學(xué)者針對(duì)病毒的N蛋白基因序列也建立了檢測(cè)TGEV的RT-PCR方法[21-22]，其中以王黎等報(bào)道的方法較好，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)pg級(jí)(10 pg)[22]。

2.1.2 多重RT-PCR 多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入一對(duì)以上的引物以同時(shí)擴(kuò)增多種靶序列的方法，自Chamberlain等人首次創(chuàng)立該方法以來(lái)[23]，已被廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定。由于與TGEV能夠產(chǎn)生相似臨床癥狀和病理變化的病原體較多，而如何在混合感染的樣品中同時(shí)鑒定多種病原微生物顯得非常重要，TGEV與其他腸道病毒的多重RT-PCR也獲得了極高的關(guān)注。

Kim等首先建立了同時(shí)診斷糞便中TGEV和豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的多重RT-PCR方法[24]，該方法可檢測(cè)到10 TCID50的最低病毒載量。鄒勇等[25]根據(jù)PEDV S基因、豬輪狀病毒(porcine group A rota virus, RV) VP7基因和TGEV S基因序列分別設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，建立了最早鑒別TGEV、PEDV和輪狀病毒的三重RT-PCR方法，該鑒別方法簡(jiǎn)單、快速、特異性好，可檢測(cè)到 1pg的TGEV RNA。Song等[26]使用與鄒勇等[25]不同的三對(duì)引物對(duì)TGEV、PEDV和RV進(jìn)行多重RT-PCR，并檢測(cè)了2004年1月至2005年5月間韓國(guó)的157 份急性仔豬胃腸炎樣品，再分別與單獨(dú)檢測(cè)三種病毒的RT-PCR結(jié)果比較，結(jié)果顯示：該方法對(duì)三種病毒檢測(cè)的特異性均為100%，檢測(cè)TGEV的靈敏度可達(dá)100%。隨后等多個(gè)研究小組均對(duì)檢測(cè)PEDV、TGEV和RV的多重RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了進(jìn)一步的探索和優(yōu)化[27-29]。張坤等建立的多重RT-PCR方法敏感性較好，能夠檢測(cè)到35 pg的TGEV-PEDV-RV三聯(lián)苗的混合RNA[30]，進(jìn)一步應(yīng)用該方法對(duì)華中地區(qū)75 份腹瀉豬糞樣進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果表明該方法的敏感性高、特異性強(qiáng)(檢測(cè)TGEV的敏感性均為100%)，可用于腹瀉樣品中PEDV、TGEV和RV的檢測(cè)[30]。焦洋[31]在國(guó)內(nèi)首次建立了同時(shí)快速鑒別診斷PEDV、TGEV和豬博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)的多重RT-PCR方法，經(jīng)臨床樣品檢測(cè)其檢測(cè)PEDV、TGEV和豬博卡病毒的最高敏感度分別為20 pg、35 pg和10 pg，且特異性均良好，可以應(yīng)用于臨床檢測(cè)。Zhao等[32]則建立了同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV、RV和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的多重RT-PCR方法，其檢測(cè)病毒敏感性分別為2.17×103、2.1×103、1.74×104和1.26×104拷貝，且特異性較好。2.1.3 巢式RT-PCR(RT-nPCR) 巢式RT-PCR又稱套式RT-PCR，是在RT-PCR的基礎(chǔ)上再設(shè)計(jì)一對(duì)或多對(duì)引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而可以提高反應(yīng)的敏感性和特異性。檢測(cè)TGEV的RT-nPCR方法由韓國(guó)學(xué)者Kim首創(chuàng)[24]，運(yùn)用該方法可對(duì)TGEV和PEDV進(jìn)行鑒別診斷，并可用于糞便樣品的現(xiàn)場(chǎng)直接檢測(cè)。韓國(guó)的Jung等人建立了多重RT-nPCR同時(shí)檢測(cè)TGEV和PEDV，該方法對(duì)人工感染和自然感染豬的空腸組織中TGEV檢測(cè)的結(jié)果與原位雜交技術(shù)完全吻合，且對(duì)TGEV的檢測(cè)敏感度可達(dá)2.4×10-4TCID50/mL[33]。Salem等進(jìn)一步建立的多重RT-nPCR成功的完成了TGEV/PEDV/RV的鑒別診斷，并運(yùn)用該方法對(duì)127 份樣品進(jìn)行了檢測(cè)[34]。2.1.4 熒光定量RT-PCR 傳統(tǒng)的PCR技術(shù)因其不能對(duì)病毒核酸進(jìn)行精準(zhǔn)定量而只能進(jìn)行定性分析，從而在很大程度上制約了PCR 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立[35]。近年來(lái)，熒光定量RT-PCR方法因其具有定量準(zhǔn)確、敏感性更高(可以檢測(cè)到幾個(gè)拷貝/μL的病毒核酸)、特異性更好等優(yōu)點(diǎn)，在TGEV診斷應(yīng)用中取得了較大進(jìn)展[2]。Chen等[36]以Invitrogen公司的LUX ( light upon extension, LUX)引物為基礎(chǔ)建立了檢測(cè)TGEV的熒光定量PCR方法，其敏感性比常規(guī)RT - PCR方法提高了10 倍。白興華等[37]首次以包含部分N基因序列的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品成功建立了TGEV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，該方法的檢測(cè)敏感性達(dá)到15.3 拷貝/μL，優(yōu)于Invitrogen公司的LUX引物法。此后，國(guó)內(nèi)外多個(gè)課題組也陸續(xù)對(duì)檢測(cè)TGEV的熒光定量RT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步探索，并建立了多個(gè)檢測(cè)靈敏度較高(檢測(cè)靈敏度≤10 拷貝/μL)的快速檢測(cè)方法[38-40]。

自Kim等[41]于2007年首次建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)TGEV和PEDV進(jìn)行了同時(shí)檢測(cè)以來(lái)，檢測(cè)TGEV與其他腸道腹瀉相關(guān)病毒的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法取得了較大的進(jìn)步。陳小金分別以PEDV、TGEV、RV的ORF3基因、S基因和VP7基因?yàn)榘谢蚪⒘藱z測(cè)3 種病毒的SYBR Green-I實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法，最低檢測(cè)下限分別為85、68和13 拷貝/μL，且特異性和重復(fù)性良好[42]。吳洋進(jìn)一步對(duì)這三種病毒的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行了優(yōu)化，檢測(cè)的靈敏度上取得了很大進(jìn)步，其檢測(cè)TGEV的最低下限為32 拷貝/μL，已在臨床診斷上具有重要意義[43]。

2.2 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù) 2000年，日本科學(xué)家Notomi等發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，因該技術(shù)具有較高的敏感性與特異性，加之無(wú)須特殊儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，所以它已被廣泛應(yīng)用。RT-LAMP技術(shù)是LAMP技術(shù)的一種延伸。Li等首次將這種技術(shù)應(yīng)用于TGEV的檢測(cè)，作者首先根據(jù)TGEV N基因設(shè)計(jì)引物建立了RT-LAMP方法[44]，該方法可以區(qū)分TGEV、PEDV、RV和豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)的感染，不需要高精尖儀器并且操作流程簡(jiǎn)單，易于推廣。高睿澤進(jìn)一步對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化，改進(jìn)了TGEV的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，在63 ℃恒溫下作用50 min，使TGEV N基因獲得了高效率特異性擴(kuò)增，可檢測(cè)到131.4 fg/μL的目標(biāo)，具有極高的靈敏性[45]。

2.3 基于納米顆粒和DNA探針技術(shù)的超靈敏PCR方法(UNDP-PCR) 在動(dòng)物疾病的診斷中常用的分子生物學(xué)方法還有很多，如核酸探針雜交技術(shù)等，該方法可以定性或定量檢測(cè)特異的病毒核酸，在TGE的臨床診斷中已取得較大進(jìn)展[35]，并逐步建立了放射性標(biāo)記探針(P32和S35等)和非放射性標(biāo)記探針(生物素、辣根過(guò)氧化物酶和地高辛等)檢測(cè)TGEV的兩大類方法。在病毒感染早期，由于病毒尚未大量復(fù)制而導(dǎo)致樣本中的病毒載量較低，當(dāng)其病毒含量低于已有檢測(cè)方法(如實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR等)的底線時(shí)將可能造成檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。Huang等于2014年根據(jù)生物條形碼技術(shù)(Biobar code assay, BCA)原理，首次將磁性微粒、金納米顆粒和核酸探針技術(shù)相結(jié)合建立了基于納米顆粒和DNA探針技術(shù)的超靈敏PCR方法(ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay，UNDP-PCR)應(yīng)用于PCV2的檢測(cè)[46]。該方法是通過(guò)先將偶聯(lián)有特異DNA探針的磁性微粒(Magnetic microparticles, MMP)與樣品雜交從而富集樣本核酸，即放大病毒的模板數(shù)量，得到MMP-病毒核酸復(fù)合體；再將包被有病毒特異性核酸識(shí)別標(biāo)簽的金納米顆粒與MMP-病毒核酸復(fù)合體雜交，形成“三明治”模型，使樣本核酸的信號(hào)得到第二次放大；最后，選擇相應(yīng)的方法把核酸識(shí)別標(biāo)簽洗脫下來(lái)并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于被洗脫下來(lái)的核酸標(biāo)簽是待檢核酸信號(hào)的放大，因此極大的提高了檢測(cè)的靈敏度[46]。運(yùn)用該方法檢測(cè)PCV2病毒核酸的靈敏度為10 拷貝/mL，是普通PCR的近500 倍[46]。隨后，該課題組又建立了同時(shí)檢測(cè)PCV2和TGEV的多重UNDP-PCR方法[47]，該方法不僅使TGEV檢測(cè)方法的靈敏度得到了更大的提高(可檢測(cè)出的最低病毒量為20 拷貝/mL)，同時(shí)開創(chuàng)了同時(shí)檢測(cè)DNA病毒和RNA病毒的超靈敏檢測(cè)技術(shù)，相信該技術(shù)將會(huì)被迅速運(yùn)用于不同病毒和不同領(lǐng)域的檢測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，在對(duì)TGE的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究中，近幾年來(lái)集中于免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法的研究成果較多。其中分子生物學(xué)方法因其具有高效、快速、準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)而在實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用，尤其是熒光定量RT-PCR，比普通的RT-PCR更敏感，特異性更高。但受到儀器設(shè)備的限制，分子生物學(xué)的診斷方法目前還無(wú)法應(yīng)用于臨床現(xiàn)地診斷。

近年來(lái)，免疫膠體金技術(shù)以其靈敏、特異和快捷等特點(diǎn)迅速發(fā)展起來(lái)，國(guó)外已開發(fā)出TGEV膠體金快速診斷試劑盒，方便快捷，非常適用于臨床現(xiàn)地檢測(cè)。我國(guó)建立的TGEV膠體金抗體檢測(cè)試紙條在特異性、靈敏度和穩(wěn)定性等方面都已取得很大進(jìn)步，不僅能檢測(cè)出病料中的TGEV，且對(duì)不同樣品的檢測(cè)結(jié)果與韓國(guó)的膠體金試劑盒一致[18]，非常適用于基層單位。因此，使診斷試劑商品化是我國(guó)今后發(fā)展TGE診斷技術(shù)的一個(gè)方向。同時(shí)，因?yàn)楦鞣N診斷方法都有其優(yōu)點(diǎn)，也存在不足，在傳統(tǒng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，多種不同診斷技術(shù)綜合運(yùn)用以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度和特異性也將是今后相關(guān)研究的一個(gè)重要發(fā)展方向。

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(編輯：李文平)

Progress on the Application of Immunology and Molecular Biology Techniques in Diagnosing of Transmissible Gastroenteritis

XIE Li-Lan1, FANG Liu-Rong2, FANG Hua-wei1, ZHANG Jun-lin1, AN Kang2, XIAO Shao-bo2*

(1.CenterofAppliedBiotechnology,WuhanInstituteofBioengineering,Wuhan430415,China; 2.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

With the increase of viral diarrhea of pigs, it’s difficult to make accurate diagnosis for transmissible gastroenteritis (TGE) by the traditional methods depending on pathological changes and clinical symptoms. In recent years, many scholars have done a lot of research about the diagnosis and detection methods of TGE, especially in immunological methods and molecular biology techniques. Accordingly, some immunological methods (virus neutralization, ELISA, immune colloidal gold technique) and molecular biology techniques (RT-PCR, reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay ) developed in diagnosis of TGE were reviewed and summarized in the thesis, in order to provide reference for the prophylaxis of TGE.

transmissible gastroenteritis; immunological technique; molecular biotechnology; diagnosis

國(guó)家自然科學(xué)基金(31402181)

謝立蘭，講師，從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。

肖少波。E-mail: vet@mail.hzau.edu.cn

2015-12-21

A

1002-1280 (2016) 02-0056-07

S852.65