趙進(jìn)，蔡兆偉，管峰*

(1. 中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

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阿爾茨海默病與PRNP突變體小鼠動(dòng)物模型

趙進(jìn)1，蔡兆偉2，管峰1*

(1. 中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

阿爾茨海默病是由β淀粉樣蛋白造成的人類神經(jīng)損傷性癡呆病之一，目前尚無治療辦法。朊蛋白是β淀粉樣蛋白的受體，是阿爾茨海默病發(fā)病過程的關(guān)鍵蛋白之一，具有傳遞神經(jīng)毒性和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的雙重作用。人朊蛋白編碼基因(PNRP)多態(tài)性影響阿爾茨海默病的潛伏期和臨床癥狀，而PRNP突變體小鼠的發(fā)現(xiàn)提升了動(dòng)物模型在朊蛋白疾病研究中的應(yīng)用價(jià)值，在一定程度上彌補(bǔ)了現(xiàn)有阿爾茨海默病動(dòng)物模型的不足。本文總結(jié)了朊蛋白在阿爾茨海默病病理中的作用及PRNP突變對(duì)阿爾茨海默病的影響，并詳細(xì)總結(jié)了PRNP突變體小鼠的發(fā)現(xiàn)及在蛋白沉淀樣病變研究中的應(yīng)用和價(jià)值，旨在為阿爾茨海默病動(dòng)物模型研究提供理論參考。

阿爾茨海默病；朊蛋白編碼基因；基因突變；小鼠模型

1 阿爾茨海默病與朊蛋白

人類的阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又稱老年性癡呆，是一種常見的以中樞神經(jīng)尤其以大腦組織β淀粉樣沉淀為主要病理癥狀的疾病，也是一種神經(jīng)退行性疾病。目前全世界大約有4400萬AD患者，已經(jīng)成為一項(xiàng)嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)，預(yù)計(jì)將來20年內(nèi)這一數(shù)字還將會(huì)增加一倍[1, 2]，該病也是引起全球人類死亡的第四大疾病。目前已知的具有類似β樣淀粉沉淀癥狀的疾病還有朊蛋白疾病，該病是由朊蛋白(prion protein, PrP)空間結(jié)構(gòu)變異引起的一類人畜共患病，包括人克雅氏病(CJD)、格斯特曼綜合癥(GSS)、家族致死性失眠綜合癥(FFI)和新型克雅氏病(vCJD)以及羊的癢病(scrapie)、牛海綿狀腦病(BSE，即“瘋牛病”)、鹿慢性消耗性疾病(CWD)等[3-5]，但至今對(duì)于這些疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，也沒有特異性治療藥物[6, 7]。在發(fā)病機(jī)制方面，不溶性的β淀粉樣沉淀一直被認(rèn)為是AD發(fā)病的根源，但最新研究表明可溶性β淀粉樣蛋白單體的毒性才是造成神經(jīng)細(xì)胞死亡的根源[7]。而朊蛋白疾病如瘋牛病則是細(xì)胞型朊蛋白(PrPC)空間結(jié)構(gòu)變異生成致病性朊蛋白(PrPSc)所引起的[8, 9]。盡管AD與朊蛋白疾病病原不同，但PrPC被證實(shí)是AD發(fā)病中的必備“兩面性”受體，在發(fā)病中PrPC既可以直接傳遞并調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白的毒性，破壞突觸傳導(dǎo)造成神經(jīng)損傷，也具有保護(hù)并修復(fù)損傷的神經(jīng)纖維、延緩并清除β淀粉樣沉淀的作用[2, 10, 11]，這可能是位于細(xì)胞膜上的不同配體或細(xì)胞因子與PrPC結(jié)合后作用不同的表現(xiàn)[12]，因此PrPC與AD具有直接關(guān)系，諸多研究也表明PrPC是AD發(fā)病過程必不可少的關(guān)鍵蛋白[7, 13-15]。另一方面，通過改變PrPC的結(jié)構(gòu)以及表達(dá)量可以有效降低患者的β淀粉樣蛋白沉淀，緩解阿爾茨海默病癥狀，PrPC已成為AD治療與藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)[11, 14, 16, 17]，在AD研究中具有重要作用。

2 阿爾茨海默病與PRNP突變

朊蛋白是多種動(dòng)物體內(nèi)正常表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，主要在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子等方面的功能[18, 19]。朊蛋白存在兩種空間結(jié)構(gòu)不同的構(gòu)象，即正常朊蛋白(PrPC)和致病朊蛋白(PrPSc)，二者一級(jí)結(jié)構(gòu)完全相同，但空間結(jié)構(gòu)不同，理化性質(zhì)也有很大差異，后者具有感染性，但無免疫性，在宿主細(xì)胞內(nèi)以PrPC為反應(yīng)底物進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致朊蛋白疾病[20]。PrPC由朊蛋白基因(prion protein gene, PRNP)編碼，小鼠的PRNP位于2號(hào)染色體，含有三個(gè)外顯子，開放閱讀框(ORF)全部位于第三個(gè)外顯子[21]。PRNP在哺乳動(dòng)物中具有高度保守性，所有動(dòng)物的ORF都編碼一個(gè)大小約為250個(gè)氨基酸的蛋白[21, 22]。PRNP多態(tài)性與物種對(duì)于朊蛋白疾病的易感性、臨床表現(xiàn)和潛伏期等有著密切關(guān)系[23]。目前已經(jīng)闡明綿羊PRNP的多個(gè)突變與羊?qū)ΠW病易感性有關(guān)，這些研究成果已經(jīng)用于綿羊抗病育種實(shí)踐[24, 25]，牛PRNP多態(tài)性也與瘋牛病的易感性相關(guān)[26]。人類PRNP第129位氨基酸存在甲硫氨酸(Met)和纈氨酸(Val)兩種多態(tài)性，該位點(diǎn)與AD潛伏期和臨床癥狀相關(guān)，但在不同人群中也存在差異[27-30]，這一多態(tài)位點(diǎn)也和人類其他朊蛋白疾病的抗性相關(guān)[5]。另外，還發(fā)現(xiàn)人PRNP的G127V和E219K與抗病性相關(guān)，而諸多突變點(diǎn)如P102L、P105L、A117V、G131V、N171S、D178N、V180I、T183A、E196K、F198S、E200K、D202N、V203I、R208H、V201I、E211Q、Q212P、Q217R和M232R則表現(xiàn)為易感性增加[31]，而I215V、S97N、F198V和R208C等突變也可能與AD相關(guān)[32, 33]。越來越多的證據(jù)表明，PRNP突變與AD存在關(guān)聯(lián)性且影響AD的進(jìn)程，PRNP突變或許通過影響PrPC的結(jié)構(gòu)而影響AD的進(jìn)程[17]，但其具體機(jī)制尚不清楚。

3 阿爾茨海默病現(xiàn)有動(dòng)物模型的研究概況

目前關(guān)于AD等類似疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，發(fā)病病例存在散發(fā)性、遺傳性和傳染性的特點(diǎn)，這些因素在很大程度上制約了AD治療藥物的篩選，而主要障礙之一是缺少合適的動(dòng)物模型[34]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過建立動(dòng)物模型復(fù)制出人類的疾病并開展病理學(xué)、藥物開發(fā)和預(yù)防治療等多方面的研究。目前人類AD動(dòng)物模型總體上分為常規(guī)模型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。常規(guī)動(dòng)物模型主要有快速老化小鼠模型、D-半乳糖(D-gal)損害模型、膽堿損害模型、鋁元素中毒模型、注射模型等[35-39]，但這些模型存在不足[40-43]，如價(jià)格昂貴、壽命短、不適于做長期實(shí)驗(yàn)，且個(gè)體差異大，不能很好的模擬人類的病理變化等缺點(diǎn)，不能很好地滿足在病理機(jī)制和藥物篩選研究方面的需要，此類動(dòng)物模型逐漸被轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型所取代。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型是近年來隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和遺傳學(xué)發(fā)展而來的，主要通過對(duì)發(fā)病具有重要影響的基因進(jìn)行沉默或超表達(dá)等手段改造而來，目前已有多個(gè)AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，在病理學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用[6, 34, 38-40, 44-48]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型相比復(fù)雜的病理過程來說還有一定差距，難以很好地呈現(xiàn)人類疾病中的病理變化；其次轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型還存在制作困難、成本高等缺點(diǎn)；最后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還存在近交衰退、繁殖率和存活率低等不足，這也是制約轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型應(yīng)用的一個(gè)重要因素[34, 49]?？傊?，現(xiàn)有的AD動(dòng)物模型在發(fā)揮其病理學(xué)研究的同時(shí)還存在與人類發(fā)病機(jī)制的差異，因此尚不能很好的滿足在AD病理學(xué)研究和藥物開發(fā)中的應(yīng)用。

4 PRNP突變體小鼠與阿爾茨海默病研究

小鼠AD動(dòng)物模型在人類AD和朊蛋白疾病研究中的應(yīng)用已有30多年的歷史。隨著對(duì)朊蛋白疾病的深入研究，在小鼠和人類基因組中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與朊蛋白疾病和AD有關(guān)的PRNP突變，其中人PRNP第129位氨基酸突變與AD和克雅氏病易感性均相關(guān)[28, 30, 50]。同時(shí)，研究人員也發(fā)現(xiàn)小鼠PRNP基因多態(tài)性影響小鼠對(duì)β淀粉樣蛋白及朊蛋白疾病的易感性且與之存在高度相關(guān)[8, 51-54]。最初采用倉鼠和小鼠的cDNA探針在近交系I/LnJ小鼠家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)位點(diǎn)，即用內(nèi)切酶Xba I 酶切小鼠DNA后分別得到3.8 kb和5.5 kb兩個(gè)不同長度的片段，這一多態(tài)性把I/LnJ小鼠分成易感性顯著不同的兩個(gè)群體：潛伏期分別為(113±2.8)d和(200-385)d，定義為Prnpa和Prnpb等位基因[52, 55]，此前也發(fā)現(xiàn)具有同樣酶切多態(tài)位點(diǎn)的C57BL和DBA小鼠具有類似差異的潛伏期[51]。后來DNA測(cè)序證明這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)為L108-T189和F108-V189等位基因[53, 56, 57]，最近還在該位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了基因型為F108-T189的小鼠[56]。對(duì)于小鼠Prnpa和Prnpb兩種多態(tài)性位點(diǎn)影響不同潛伏期的分子機(jī)制，體外研究表明二者形成的蛋白在二級(jí)結(jié)構(gòu)及物理特性上幾乎完全一致，但在蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過程中Prnpb結(jié)構(gòu)的遲滯期明顯長于Prnpa型蛋白(平均為140 h和36 h)，盡管這種轉(zhuǎn)化的時(shí)間受到病原種類特異性的影響，但推測(cè)轉(zhuǎn)換的時(shí)間是由宿主本身的PrPC一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的[54]，且小鼠PrPC的100-104位氨基酸對(duì)PrPSc生成具有重要影響[58]。在目前研究的實(shí)驗(yàn)小鼠中已發(fā)現(xiàn)5個(gè)具有抗性的小鼠家系，即I/LnJ、RⅢS/J、P/J、MA和MyJ，而易感性的小鼠家系主要有21個(gè)，包括NZW/LacJ、BALB/cJ、BUB/BnJ、CBA/J、CE/J、C3H/HeSn、C57BL/6J、C57BL/10Sn和DBA/2J等；雜交及回交實(shí)驗(yàn)證明這些突變體小鼠的易感性受到單一基因PRNP控制，且具有抗性的Prnpb等位基因?yàn)轱@性基因，這些PRNP突變體小鼠為AD和朊蛋白疾病研究提供了新的平臺(tái)和材料[52, 56, 59, 60]，在病理學(xué)研究、臨床癥狀研究和醫(yī)藥開發(fā)等領(lǐng)域逐步發(fā)揮出其不可替代的作用。

PRNP突變體小鼠模型的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)AD治療和藥物開發(fā)研究提供了全新的參考依據(jù)，但是其不同突變品種(系)的易感性不同，限制了小鼠模型的規(guī)范化使用。Shirai等[61]對(duì)小鼠不同的PRNP突變做了系統(tǒng)的研究和易感性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明最易導(dǎo)致蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的PRNP突變點(diǎn)位于PrP氨基酸的K103-A119和S131-M137兩個(gè)區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域均為PrPC結(jié)構(gòu)中N-端的核心區(qū)。細(xì)胞模型研究顯示，最易于改變?nèi)S結(jié)構(gòu)的突變點(diǎn)V121I大大增加了PrPC向致病性PrPSc結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的概率(提高了23.3倍)，其他影響轉(zhuǎn)變的依次還有K105R(17.1倍)、A115S(16.5倍)、H176R(15.6倍)、A115W(15.5倍)、A117V(14.8倍)、Y127I(13.4倍)、A115N(12.7倍)、P104T(12.1)和A115Y(10.6倍)。這一研究結(jié)果對(duì)PRNP突變體小鼠模型在AD研究中的應(yīng)用提供了重要參考。

5 小結(jié)與展望

AD是全球老年性癡呆病的代表性疾病，約占癡呆病患者的70%，嚴(yán)重危害人類健康，世界多國因此開展了病理和治療方面的研究，但至今尚無治療辦法。遺傳學(xué)和病理學(xué)方面的研究部分揭開了AD的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也創(chuàng)制了多種動(dòng)物模型，尤其是基因突變體小鼠的發(fā)現(xiàn)豐富了現(xiàn)有動(dòng)物模型的多樣性，為AD及相關(guān)疾病的研究提供了一些新型材料，推動(dòng)了AD的研究進(jìn)程。另外，在AD小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)了?；敲撗跄懰?TUDCA)和熊去氧膽酸(UDCA)可以有效治療AD癥狀[62]，而苔蘚提取物和肝素類物質(zhì)以及干細(xì)胞在治療AD方面也已顯現(xiàn)出良好的前景。隨著更加豐富多樣的AD動(dòng)物模型的開發(fā)應(yīng)用以及新品種培育，必將推動(dòng)在病理學(xué)及藥物開發(fā)治療等方面的進(jìn)展。但同時(shí)還有許多尚需解決的問題，如何有效控制這些疾病的跨物種傳播以及如何克服耐藥性問題都將是科研工作者面臨的難題，不過隨著研究的進(jìn)展人們必將全面了解AD等疾病并能通過掌握的知識(shí)造福于人類的健康和發(fā)展。

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Alzheimer’s disease and PRNP mutational mouse models

ZHAO Jin1, CAI Zhao-wei2, GUAN Feng1*

(1. China Jiliang University, College of Life Sciences, Hangzhou 310018, China；2. Zhejiang Chinese Medical University, Laboratory Animal Research Center, Hangzhou 310053)

Alzheimer’s disease (AD) is one of the most common dementia of neurodegenerative disorders, which results from the deposition of amyloid-beta (Aβ) and there are no curative treatments for this disease at present. It had been proved that prion protein is the receptor for Aβ and it plays a key role in the progress of AD with dual-side effects. Prion protein can not only transfer neurotoxicity to neurons but also protect them from neurotoxicity of Aβ. The polymorphisms of prion protein encoding gene (PRNP) affect the AD incubation period and clinical symptoms in humans and other animals. The discovery of PRNP mutational mouse fills the gaps of existing AD mouse models in this research area, which is potential for the studies of pathogenesis, new drugs design and testing aspects. The role and effects of prion protein in AD pathogenesis were summarized in this paper, furthermore, the discovery and utility of PRNP gene mutational mouse in research on AD and/or amyloid diseases were reviewed, and in order to provide some guidance for AD animal model study.

Alzheimer’s disease (AD); Prion protein encoding gene (PRNP); Gene mutation; Mouse model

GUAN Feng. E-mail: guanfengzgjl@163.com

浙江省科技廳公益技術(shù)應(yīng)用研究(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2016C37114)。

趙進(jìn)，男，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail： zhaojin@cjlu.edu.cn

管峰，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物分子遺傳研究。E-mail： guanfengzgjl@163.com

研究進(jìn)展

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0541-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.019

2016-03-08