李會(huì)娟　袁超寧　龍　超　馬海明　范長(zhǎng)寶　齊冉冉　李淑英

(辛集市第二醫(yī)院，河北　辛集　052360)

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人乳頭瘤病毒感染對(duì)中老年婦女宮頸病變?cè)缙诤Y查的意義

李會(huì)娟袁超寧1龍超2馬海明2范長(zhǎng)寶2齊冉冉2李淑英2

(辛集市第二醫(yī)院，河北辛集052360)

目的通過(guò)人乳頭瘤病毒(HPV)感染狀況的檢測(cè)，對(duì)中老年婦女宮頸病變患者進(jìn)行早期篩查，為宮頸癌的防治提供理論依據(jù)。方法采用導(dǎo)流雜交技術(shù)對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV感染狀況檢測(cè)，并對(duì)HPV陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)診斷分析。結(jié)果2 260例宮頸脫落細(xì)胞中385例感染HPV，檢測(cè)到6種高危型HPV(包括HPV16、18、58、52、31及33)和2種低危型HPV(包括HPV6及11)，高危型以HPV16、18和58三型別感染為主，并且宮頸病變程度隨HPV感染的陽(yáng)性率增加而加重。結(jié)論高危型HPV感染可能是中老年婦女宮頸病變的主要病原因子。

人乳頭瘤狀病毒；宮頸病變；感染

HPV是一種雙鏈環(huán)狀的小分子DNA病毒。目前有130多種HPV型別已確定，其中40多種型別感染與生殖道疾病有關(guān)；依據(jù)感染的HPV型別與宮頸病變危險(xiǎn)性的高低分為低危型HPV和高危型HPV，低危型常引起外生殖器濕疣等良性病變，高危型則與子宮頸癌及子宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生相關(guān)〔1〕。為了解中老年婦女HPV感染狀況及其分型，本研究采用導(dǎo)流雜交技術(shù)和細(xì)胞病理學(xué)診斷技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)2 260例中老年婦女宮頸病變患者進(jìn)行早期篩查，以便對(duì)宮頸病變患者進(jìn)行及早治療。

1　資料與方法

1.1一般資料用無(wú)菌棉簽在被檢者的宮頸口按同一方向旋轉(zhuǎn)5圈后取出，用生理鹽水洗脫棉簽中細(xì)胞，然后將所收集的標(biāo)本分成兩份：分別用于病理細(xì)胞學(xué)診斷、DNA提取進(jìn)行感染HPV型別的檢測(cè)。收集2013年1月至2014年6月門診就診中老年婦女2 260例的宮頸脫落細(xì)胞，年齡46～65〔平均(58.0±6.0)〕歲，均來(lái)源于辛集市，無(wú)子宮頸椎切和子宮切除史。

1.2研究方法

1.2.1病理細(xì)胞學(xué)診斷采用2001 Bethesda system分級(jí)系統(tǒng)及Autocyte液基薄層全自動(dòng)制片機(jī)(美國(guó)TriPath Imaging公司產(chǎn)品)制片、染色，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察分析。

1.2.2HybriMax?導(dǎo)流雜交法檢測(cè)HPV該系統(tǒng)可以同時(shí)檢測(cè)21種不同型別的HPV(由廣東凱普生物科技有限公司提供)，包括6種低危型(6、11、42、43、44及81)和15種高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)。①樣本DNA提?。喊丛噭┖姓f(shuō)明書操作：即將所收集的宮頸脫落細(xì)胞500 μl轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，14 000 r/min離心5 min，棄去上清，然后加入400 μl溶液Ⅰ混勻，加熱至100℃15 min，冷卻后，加入400 μl溶液Ⅱ，混勻，室溫下靜置2 min，14 000 r/min離心5 min，去上清；再加入60 μl溶液Ⅲ充分溶解，做PCR的模板備用。②PCR擴(kuò)增：按試劑盒說(shuō)明操作：將試劑盒中各PCR成分加好后，分別加入上述已提取樣品DNA 1 μl作為模板，反應(yīng)總體系為25 μl。PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)：95℃/10 min；然后95℃/20 s，55℃/30 s，72℃/30 s 擴(kuò)增40循環(huán)，最后72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物95℃變性5 min后，放入冰水中，確保PCR管底部完全浸入冰水中，冰水浴2～5 min。③導(dǎo)流雜交：在有雜交膜的雜交孔內(nèi)加入1 ml預(yù)熱至45℃的雜交液，蓋上蓋板溫育至少2 min后，排出雜交液，吸取0.5 ml預(yù)熱至45℃的雜交液，加到反應(yīng)槽每個(gè)孔中。將冰水浴中的PCR產(chǎn)物取出，分別加入反應(yīng)槽各孔中，蓋上蓋板，45℃條件下雜交10 min。雜交后，開泵進(jìn)行導(dǎo)流雜交。④洗膜：將雜交膜上的溶液排凈，用45℃的雜交液沖洗膜3次。⑤顯色：加入0.5 ml封阻液封閉膜，然后排凈所有預(yù)封阻的封阻液，再加入0.5 ml封阻液封閉膜，蓋上蓋板封閉5 min。將封阻液完全排凈。再加入0.5 ml酶標(biāo)液，蓋上蓋板溫育3.5 min；將酶標(biāo)液徹底排凈。再用溶液A沖洗膜3次，將雜交膜上的溶液徹底排凈，加入0.5 ml NBT/BCIP溶液，蓋上蓋板顯色5 min，再用溶液B沖洗膜3次，觀察結(jié)果。

2　結(jié)　果

2.1HPV感染狀況2 260例宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，經(jīng)過(guò)HybriMax?導(dǎo)流雜交系統(tǒng)檢測(cè)后，檢測(cè)到385例感染HPV，其中高危型329例，包括HPV16(119例，5.3%)、18(81例，3.6%)、58(51例，2.5%)、52(22例，2.3%)、31(25例，1.4%)及33(31例，1.5%)共6種，低危型56例，包括HPV6(35例，1.5%)及11(21例，0.9%)。

2.2HPV感染與宮頸病變的關(guān)系依據(jù)Bethesda分級(jí)系統(tǒng)，將329例高危型HPV陽(yáng)性者進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷為：未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)91例(27.6%)；低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)115例(35.0%)；高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)123例(37.4%)。結(jié)果顯示，隨病變程度加重，高危型HPV陽(yáng)性率逐漸增加。

3　討　論

高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸病變的主要病原因子，高危型特異性E區(qū)基因疫苗的研制為宮頸病變的治療提供了新的靶點(diǎn)。有研究證實(shí)13種高危型HPV長(zhǎng)期反復(fù)地感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件〔2～4〕。目前，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)130種不同型別的HPV，在所有宮頸癌病例中約70%以上是HPV16和HPV18型感染〔5〕。因此，對(duì)HPV型別尤其是高危型進(jìn)行分型研究，對(duì)了解宮頸病變，判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療有重要臨床意義。本次研究顯示，2 260例被檢者中，HPV感染率為17.0%，低危型HPV6及11兩種型別占56例；高危型HPV16、18、58、52、31及33六種型別占329例；感染型別頻率排在前3位的是HPV16、18及58型，16型感染率居于首位。與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的基本一致〔6～9〕，進(jìn)一步提示HPV16、18及58型感染可能是宮頸癌發(fā)生的重要病原因子。本研究還顯示：隨宮頸病變程度加重，高危型HPV檢出率明顯升高的趨勢(shì)。該項(xiàng)研究反映了辛集地區(qū)主要流行HPV6、18及58型。細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，隨細(xì)胞學(xué)診斷病變級(jí)別增加呈逐步上升趨勢(shì)，HPV陽(yáng)性率明顯增加，提示中老年女性要加強(qiáng)查體意識(shí)，定期做HPV型別及病例細(xì)胞學(xué)診斷篩查，早期發(fā)現(xiàn)病變，并根據(jù)HPV的型別檢出情況定期篩查疾病，做到預(yù)防為主，及早發(fā)現(xiàn)疾病，積極控制HPV感染對(duì)防治宮頸病變具有臨床意義。

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〔2015-05-11修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省科研基金項(xiàng)目(No：132777136)

李淑英(1964-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事病毒相關(guān)腫瘤的研究。

李會(huì)娟(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事病毒相關(guān)腫瘤的研究。

R17

A

1005-9202(2016)18-4538-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.068

1辛集市第一醫(yī)院2華北理工大學(xué)