張志國(guó)，田鑫，陳媛，孫迪

(齊魯工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

非水酶催化及其在香精香料合成中的應(yīng)用

張志國(guó)*，田鑫，陳媛，孫迪

(齊魯工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

概述了非水酶催化的歷史、非水酶催化的優(yōu)點(diǎn)，闡述了有機(jī)溶劑、離子液、SCF等非水酶催化的介質(zhì)，最后就利用非水介質(zhì)酶催化短鏈芳香酯、芳香內(nèi)酯、香蘭素等香料的合成進(jìn)行了綜述。

非水酶；催化；香料

在非水介質(zhì)中進(jìn)行酶催化反應(yīng)的研究稱非水酶學(xué)(Non-aqueous Enzymology)。非水酶學(xué)是近年來(lái)酶學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要分支，非水介質(zhì)酶催化是目前生物技術(shù)、有機(jī)合成等領(lǐng)域的前沿性課題之一。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為酶只能在水溶液環(huán)境中進(jìn)行催化，但近年來(lái)的研究證明，酶在非水介質(zhì)中仍可表現(xiàn)出催化活性，并且表現(xiàn)出在水介質(zhì)中所不具有的特有的催化特性。非水介質(zhì)酶催化的用途很多，近年來(lái)其在香精香料的制備中有了一定發(fā)展。

1 非水介質(zhì)酶催化的歷史

早在1936年，美國(guó)華沙大學(xué)的Sym就在BiochemistryJournal上報(bào)道了酯酶在有機(jī)溶劑中的催化作用[1]，但當(dāng)時(shí)由于對(duì)此存在爭(zhēng)議，未能引起有關(guān)學(xué)者進(jìn)行進(jìn)一步研究的興趣。1977年，前蘇聯(lián)的Klibanov在“水-非水溶性有機(jī)溶劑”兩相體系中，用胰蛋白酶合成了L-色氨酸乙酯，結(jié)果表明在水反應(yīng)體系中，酯的產(chǎn)率僅有0.01%，在“水-非水溶性有機(jī)溶劑”兩相體系中，酯的產(chǎn)率接近100%，證實(shí)了在接近無(wú)水的條件下，有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行[2]。1984年，他又與Zaks合作，在Science上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化作用的論文。他們?cè)趦H含微量水的有機(jī)介質(zhì)(Microaqueous Media)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等許多有機(jī)化合物，并證實(shí)了酶在100 ℃高溫下，不僅能夠在有機(jī)溶劑中保持穩(wěn)定，而且還顯示出很高的催化轉(zhuǎn)酯活力[3]。他們的發(fā)現(xiàn)在世界范圍內(nèi)引起了對(duì)非水介質(zhì)酶催化的興趣，這一發(fā)現(xiàn)為酶學(xué)研究和應(yīng)用帶來(lái)了一次革命性飛躍，打破了傳統(tǒng)的生物催化概念，將酶引入非水介質(zhì)中，并成為酶學(xué)和有機(jī)合成研究中一個(gè)迅速發(fā)展的新領(lǐng)域，開(kāi)辟了酶學(xué)研究領(lǐng)域的另一個(gè)重要分支——非水酶學(xué)，開(kāi)啟了非水酶學(xué)研究的先河。

1987年，中國(guó)科學(xué)院上海生化所黃中祥[4]在我國(guó)首先進(jìn)行了有機(jī)溶劑中酶催化反應(yīng)的報(bào)道。之后，吉林大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室的羅貴民[5]、湖北大學(xué)的曾和平[6]陸續(xù)進(jìn)行了非水介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的報(bào)道，但這些都僅限于綜述性的報(bào)道。直到1991年，曹淑桂等[7]報(bào)道了豬胰脂肪酶在凍干時(shí)的pH值、有機(jī)溶劑的極性、反應(yīng)系統(tǒng)的含水量、溫度以及底物碳鏈的長(zhǎng)度和支鏈對(duì)酶在有機(jī)相中催化活性的影響規(guī)律，并利用該酶合成了具有玫瑰香味的月桂酸香茅酯和辛酸香茅酯。此后，在我國(guó)真正意義的非水酶催化研究才陸續(xù)展開(kāi)。

2 非水介質(zhì)酶催化的優(yōu)點(diǎn)

非水相中的酶催化之所以引起人們?nèi)绱舜蟮呐d趣，是因?yàn)槊冈谟袡C(jī)溶劑中表現(xiàn)出了全新的性質(zhì)。例如酶在非水相中可以催化許多在水相中不可能進(jìn)行的反應(yīng)，而它本身卻十分地穩(wěn)定。與在水相中進(jìn)行的酶促反應(yīng)相比，非水相酶催化具有以下優(yōu)點(diǎn)：有利于疏水性底物的反應(yīng)；可提高酶的熱穩(wěn)定性；能催化在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)；可改變反應(yīng)平衡移動(dòng)方向；可控制底物專一性；可防止由水引起的副反應(yīng)；可擴(kuò)大反應(yīng)pH值的適應(yīng)性；酶和產(chǎn)物易于回收；可避免微生物污染[8，9]。

3 非水介質(zhì)的類型

近年來(lái)，對(duì)酶在非水介質(zhì)中的催化作用的研究日趨增多，從最早的以有機(jī)溶劑作為非水介質(zhì)，發(fā)展到離子液[10]、超臨界流體[11]等作為酶反應(yīng)的介質(zhì)，值得注意的是非水介質(zhì)并非絕對(duì)無(wú)水，由于酶需要有一定量的水來(lái)維持其催化活性。在非水酶學(xué)研究中，存在一種共識(shí)，在非水或低水環(huán)境中，只要酶分子的“必需水”層不被剝除，酶就可以有效地發(fā)揮其催化作用，這種與水溶液環(huán)境相差很大的酶催化反應(yīng)環(huán)境稱為“非水相”或“非水介質(zhì)”。

3.1 有機(jī)溶劑

在非水介質(zhì)酶學(xué)研究中，以有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)是研究最早、也是研究最多的一種非水介質(zhì)，所以，常將以有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)的酶催化稱為有機(jī)介質(zhì)中的酶催化。Zaks提出了非水相酶學(xué)的一個(gè)具有普遍意義的定律：作為反應(yīng)介質(zhì)，非極性溶劑優(yōu)于極性溶劑。由于極性溶劑，特別是與水互溶的有機(jī)溶劑會(huì)爭(zhēng)奪，甚至剝除蛋白質(zhì)分子的“必需水”層，擾亂酶分子天然構(gòu)象的形成。這一說(shuō)法確實(shí)可以作為 Zaks定律的一個(gè)合理解釋。Zaks和 Klibanov檢測(cè)了在各種溶劑中水對(duì)醇脫氫酶、醇氧化酶及多酚氧化酶活性的影響，結(jié)果表明：有機(jī)溶劑是通過(guò)與酶分子周圍的水層而不是酶分子本身發(fā)生作用的。他們還發(fā)現(xiàn)，隨著增加溶劑中的水含量，酶的活力迅速增加。表達(dá)有機(jī)溶劑對(duì)酶催化活力影響的一個(gè)比較準(zhǔn)確，或者說(shuō)是較為有意義的術(shù)語(yǔ)是溶劑“扭曲(或擾動(dòng))”酶的水結(jié)合區(qū)的能力，即有機(jī)溶劑穿透并進(jìn)入催化劑的“必需水”層，或?qū)ⅰ氨匦杷蓖崎_(kāi)或拉脫的能力。溶劑的這種水?dāng)_動(dòng)能力與其性質(zhì)密切相關(guān)。Laane等深入研究了107 種溶劑的理化性質(zhì)與酶功能的相關(guān)性，其中包括 Hildebrand(希爾德布蘭德)溶解度參數(shù)(δ)、介電常數(shù)(ε)、偶極矩(μ)以及疏水常數(shù)(log P，辛醇-水雙相體系中的分配系數(shù))，發(fā)現(xiàn)log P與酶活力之間具有最好的相關(guān)性，用log P表征溶劑極性時(shí)，酶活性與溶劑極性之間具有更好的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)酶催化活性與溶劑疏水常數(shù)之間的關(guān)系是一條S 形曲線，在log P<2的極性溶劑中的催化活性較低，在2 4的非極性溶劑中催化活性較高[12]。

3.2 離子液

離子液體一般是指由體積相對(duì)較大的有機(jī)陽(yáng)離子和體積相對(duì)較小的無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成、在室溫或近于室溫下呈液態(tài)的物質(zhì)，是一種低熔點(diǎn)的鹽(<100 ℃)。與常規(guī)的有機(jī)溶劑不同的是，離子液沒(méi)有蒸汽壓，能夠溶解多種物質(zhì)，可溶解一般有機(jī)溶劑不能溶解的底物，并且可以和多種溶劑形成兩相體系，具有低毒、穩(wěn)定、不揮發(fā)等特點(diǎn),被稱為綠色反應(yīng)介質(zhì)。離子液體可提高酶的穩(wěn)定性，維持酶的催化活性[13]。由于離子液所具有的獨(dú)特性質(zhì)，使其成為一種生物催化反應(yīng)的理想溶劑。但是，目前離子液的價(jià)格還很高，價(jià)格因素將限制其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。

3.3 超臨界流體

超臨界流體指溫度和壓力均在本身的臨界點(diǎn)以上的高密度流體，具有和液體同樣的凝聚力、溶解力；然而其擴(kuò)散系數(shù)又接近于氣體，是通常液體的近百倍。超臨界CO2是應(yīng)用最廣泛的超臨界流體，它不但具有超臨界流體的一般特性，而且還具有無(wú)毒、無(wú)害、不燃燒、無(wú)污染、容易回收和可循環(huán)利用等特點(diǎn)，是環(huán)境友好的綠色溶劑。但是超臨界CO2作為非水酶催化的反應(yīng)介質(zhì)僅限制在以低極性的底物的作為反應(yīng)底物催化反應(yīng)中[14]。

4 非水酶催化在合成香料中的應(yīng)用

4.1 短鏈芳香酯的合成

短鏈芳香酯類香料是日化香精和食用香精的調(diào)香配方中十分重要的香料品種,應(yīng)用十分廣泛。傳統(tǒng)短鏈芳香酯類香料的合成方法主要是醇和有機(jī)羧酸之間的直接酯化法。使用最多的是以成本低廉的濃硫酸作催化劑，由于該工藝存在設(shè)備腐蝕、環(huán)境污染、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、副反應(yīng)較多、后處理操作比較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)料等一系列不足,與食用安全、綠色化學(xué)和清潔生產(chǎn)要求格格不入,因此急需開(kāi)展新工藝技術(shù)的研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。在非水介質(zhì)中使用脂肪酶催化酯化反應(yīng)生產(chǎn)食用香料是一個(gè)很好的選擇。Maha等利用脂肪酶催化合成了戊酸乙酯(青蘋果味)和乙酸己酯(桃子味)[15]。Gubicza等利用Novozyme 435脂肪酶催化合成了乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丙酸異戊酯、丁酸乙酯、丁酸異戊酯等短鏈芳香酯[16]。Rajnish等以超臨界CO2作為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行了脂肪酶催化不同脂肪酸與異戊醇發(fā)生酯化反應(yīng)形成不同種香料的研究[17]。Rachna等利用固定化玫瑰酵母以異辛烷作為反應(yīng)介質(zhì)合成了己酸乙酯[18]。

4.2 芳香內(nèi)酯的合成

芳香內(nèi)酯是羥基脂肪酸分子經(jīng)過(guò)分子內(nèi)酯化形成的化合物，具有濃郁的香氣，在各種具有水果味、可可味、奶酪味及堅(jiān)果味的食品中都曾分離得到γ-內(nèi)酯和δ-內(nèi)酯，而某些大環(huán)ω-內(nèi)酯具有珍貴的麝香香味，它們?cè)谑称泛突瘖y品工業(yè)中有重要應(yīng)用價(jià)值。Ahmed等利用來(lái)自洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)的脂肪酶催化合成了γ-內(nèi)酯和δ-內(nèi)酯[19]。沈芳等利用固定化Candidasp.GXU08 菌株產(chǎn)脂肪酶催化15-羥基十五烷酸甲酯合成環(huán)十五內(nèi)酯(δ-內(nèi)酯)[20]。

4.3 香蘭素的合成

香蘭素是在食品、香水、制藥等行業(yè)被普遍應(yīng)用的香料之一。1816年，香蘭素第一次被從香莢蘭豆莢中分離得到，其結(jié)構(gòu)在1874年被確定。如今，全世界的香蘭素消耗量每年大約在12000噸，大約有50噸的天然香蘭素來(lái)自香蘭豆莢，其余的來(lái)自化學(xué)合成。由于香蘭豆莢的來(lái)源有限，受產(chǎn)地、天然等因素的影響，成本高致，使天然香蘭素的價(jià)格昂貴。盡管如此，利用植物提取法生產(chǎn)的天然香蘭素?zé)o法滿足市場(chǎng)的需求，再加上美國(guó)和歐盟等標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，化學(xué)合成的風(fēng)味物質(zhì)不能用作天然風(fēng)味，使研究者越來(lái)越感興趣于利用其他的天然資源，如利用生物技術(shù)來(lái)生產(chǎn)天然香蘭素。近年來(lái)對(duì)微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素的研究較多，但一般情況下香蘭素只是中間代謝產(chǎn)物，會(huì)繼續(xù)降解而不易積累。因此，除了繼續(xù)設(shè)法尋找可在代謝途徑中積累香蘭素的菌株外，用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香草醛是近年來(lái)又一個(gè)很有前景的研究方向[21]。Mane等利用大豆脂氧合酶將異丁香酚轉(zhuǎn)化為香蘭素[22]，并申請(qǐng)了美國(guó)專利。李永紅等也在利用大豆脂氧合酶法轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香蘭素方面獲得了成功[23]。

4.4 其他應(yīng)用

酶作為高效的生物催化劑，還可以進(jìn)行光學(xué)活性物質(zhì)的拆分或合成。薄荷醇，其俗名為薄荷腦，又名六氫百里香酚，是一類非常重要的香料，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)，是一個(gè)典型的被酶有效拆分的香料。薄荷醇分子中存在3個(gè)手性中心，理論上有8個(gè)立體異構(gòu)體，各具有不同的物理性質(zhì)，在8個(gè)立體異構(gòu)體中，只有D-薄荷醇和L-薄荷醇具有應(yīng)用價(jià)值，L-薄荷醇具有特有的薄荷香氣并有強(qiáng)烈的清涼作用，而D-薄荷醇卻無(wú)清涼作用，而且還具有辛辣刺激性氣味，微帶樟腦氣味。正是由于這些差異，使得L-薄荷醇比D-薄荷醇有更高的應(yīng)用價(jià)值，所以要對(duì)其進(jìn)行手性拆分。Elisabetta等用脂肪酶對(duì)薄荷醇的消旋混合物成功地進(jìn)行了拆分[24]。

奶味香精是食品工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的香精之一，主要用于冷食、糖果、飲料等的增香。武彥文等利用脂肪酶對(duì)不同類型的奶油、奶酪和牛奶等進(jìn)行酶解，以乙醇或丙酮為溶劑在非水介質(zhì)下得到了奶香濃郁、賦香效果明顯的奶味香精[25]。

5 結(jié)束語(yǔ)

非水相酶催化是目前生物技術(shù)中的前沿性課題之一，其在香精香料中的應(yīng)用研究正在日益開(kāi)展，盡管某些產(chǎn)品還僅限于在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，但隨著非水酶學(xué)的研究深入，目前非水酶催化反應(yīng)研究已取得了較大發(fā)展，相信今后會(huì)有更多的香精香料產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)非水酶催化的規(guī)?；窈蠊I(yè)生產(chǎn)。

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Non-aqueous Enzymatic Catalysis and Its Application in Synthesis of Flavors and Fragrances

ZHANG Zhi-guo*, TIAN Xin, CHEN Yuan, SUN Di

(College of Food Science and Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353, China)

Summarize the history and advantages of non-aqueous enzymatic catalysis; expound the non-aqueous medium of enzymatic catalysis such as organic solvent, ionic liquid, SCF and so on. Finally, review the synthesis of short chains of aromatic esters, aromatic lactone, vanillin and other spices catalyzed with non-aqueous medium enzymes.

non-aqueous enzyme; catalysis; spices

2016-06-15 *通訊作者

張志國(guó)(1974-)，男，副教授，博士，主要從事食品資源開(kāi)發(fā)方面的研究； 田鑫(1992-)，男，碩士，主要從事食品資源開(kāi)發(fā)方面的研究。

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.031

1000-9973(2016)12-0134-04