程永靜，張春媚，陳穎娟，王芳，高明，黃慈波

(北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100730)

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·論著·

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清α-微管蛋白的檢測(cè)及與臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

程永靜，張春媚，陳穎娟，王芳，高明，黃慈波

(北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100730)

[摘要]目的利用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)測(cè)定類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清中的α-微管蛋白(α-tubulin)的水平，評(píng)價(jià)與臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系，為尋找RA新的血清學(xué)標(biāo)記物，探討疾病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。方法選取RA患者68例，骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者32例，健康對(duì)照(HC)32例，各取血清10 μL，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)不同患者及健康對(duì)照血清α-tubulin水平，應(yīng)用非配對(duì)資料的t檢驗(yàn)分析不同患者與健康對(duì)照者之間α-tubulin水平的差異,相關(guān)性檢驗(yàn)分析α-tubulin水平與RA患者年齡、病程、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平、DAS28評(píng)分、類風(fēng)濕因子(RF)水平、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)水平的相關(guān)性。結(jié)果RA患者血清α-tubulin的水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎患者及健康對(duì)照(P<0.05)，進(jìn)一步分析提示α-tubulin水平與RA患者病程長(zhǎng)短呈正相關(guān)(r=0.307,P=0.023)，與血清類風(fēng)濕因子水平及IgA水平呈正相關(guān)(r=0.558,P=0.0001; r=0.395,P=0.004)。結(jié)論 α-tubulin是RA新的血清學(xué)標(biāo)記物，在RA患者的免疫反應(yīng)中具有一定的意義，可能參與了RA的發(fā)病。

[關(guān)鍵詞]關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)濕;微管蛋白; 自身免疫;免疫球蛋白類

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性全身性自身免疫病，在我國(guó)的患病率約為0.2%～0.93%[1]，是一種嚴(yán)重的致殘性疾病,嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量和身心健康。近年來(lái)，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的發(fā)現(xiàn)及TNF-α拮抗劑的應(yīng)用提高了RA的診斷率，改善了患者的生存質(zhì)量及預(yù)后[2-3]。但由于發(fā)病機(jī)制不明確，仍有很多早期、不典型病例未能得到及時(shí)診斷及治療?；诂F(xiàn)狀，迫切要求找到與疾病相關(guān)的、新的生物標(biāo)記物。目的是更深入的了解RA的病理過(guò)程，尋找可能的途徑阻斷疾病的病理過(guò)程，尋找RA診斷及治療的新的作用靶點(diǎn)。

α微管蛋白(α-tubulin)是細(xì)胞骨架蛋白微管蛋白的亞單位之一，國(guó)外學(xué)者通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)α-tubulin在RA的血清有升高的趨勢(shì)，但缺乏進(jìn)一步與臨床資料關(guān)系及發(fā)病機(jī)制的探討[4]。本研究擬用酶聯(lián)免疫吸附方法，測(cè)定RA患者血清中α-tubulin的水平，明確α-tubulin與RA各臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)系；為RA的早期診斷尋找新的生物學(xué)靶點(diǎn)，為評(píng)估病情、探討疾病發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象68例RA患者均為2010—2014年期間在北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院患者，符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)制定的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)[5]。其中，女56例，男12例；年齡18～75歲，平均(56.8±10.7)歲；病程1～10年，平均(1.5±2.3)年。選取年齡、性別相匹配的32例骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者，32例健康志愿者作為健康對(duì)照組。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集每例取血2 mL，3000 r/min,離心15 min,取上清,保存于-80 ℃。

1.2.2ELISA方法檢測(cè)血清中的α-tubulin水平α-tubulin的檢測(cè)采用α-tubulin ELISA檢測(cè)試劑盒(Novateinbio公司)。將ELISA檢測(cè)板常溫放置20 min，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入標(biāo)準(zhǔn)孔，將5倍稀釋的血清樣本50 μL加入樣本孔，同時(shí)加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗α-tubulin抗體100 μL，37 ℃孵育1 h。清洗96孔板，加入50 μL底物A(0.02% H2O2)、底物B(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，TMB)，37 ℃避光孵育15 min。加入1M硫酸終止液50 μL。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照曲線方程計(jì)算樣本的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)RA、OA與健康對(duì)照之間血清α-tubulin水平的差異采用獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)。對(duì)α-tubulin與RA疼痛關(guān)節(jié)數(shù)，腫脹關(guān)節(jié)數(shù)等非連續(xù)性變量之間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，對(duì)α-tubulin與年齡、病程、ESR、CRP、DAS28評(píng)分、RF水平 、IgG、IgA、IgM等聯(lián)系性變量之間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RA患者與健康對(duì)照者血清中的α-tubulin水平比較RA患者血清中α-tubulin水平[(37.90±37.09) μg/L]明顯高于健康對(duì)照[(14.52±10.99) μg/L]，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.824,P<0.01); 骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者血清中的α-tubulin水平[(15.59±15.64) μg/L]與健康對(duì)照[(14.52±10.99) μg/L]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=0.334,P=0.739)。

2.2α-tubulin水平與RA臨床及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)性分析將RA患者血清α-tubulin水平與患者年齡、病程、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白水平、DAS28評(píng)分、類風(fēng)濕因子水平、免疫球蛋白水平等臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)α-tubulin水平與RA患者RF及IgA水平呈正相關(guān)(r=0.558,P=0.0001;r=0.395,P=0.004，如圖1所示)，與病程長(zhǎng)短呈正相關(guān)(r=0.307,P=0.023)。

3討論

微管蛋白是細(xì)胞的一種骨架蛋白，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和胞器定位等細(xì)胞功能起關(guān)鍵作用。α-tubulin和β-tubulin兩種蛋白亞單位與微管輔助蛋白(MAPs) 一同構(gòu)成微管,兩者交替以螺旋狀形式形成二聚體,并首尾相連構(gòu)成原纖維,對(duì)細(xì)胞有明顯的支持作用,被認(rèn)為是細(xì)胞的主要“骨骼”。通常情況下,α-tubulin和β-tubulin的表達(dá)水平不會(huì)發(fā)生改變，因此常被用于蛋白差異表達(dá)研究的內(nèi)參。

目前對(duì)微管蛋白的研究多集中在腫瘤方面。研究發(fā)現(xiàn)微管蛋白的表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生和細(xì)胞增殖失控,以及腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為相關(guān)[6]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖活躍時(shí)，有絲分裂處于活躍狀態(tài)，相應(yīng)的微管蛋白異常表達(dá)。因此，研究者將微管蛋白作為腫瘤細(xì)胞增殖的血清學(xué)標(biāo)記物之一[7]。同時(shí)，微管穩(wěn)定劑(MSAs)，一種靶點(diǎn)在微管蛋白的抗腫瘤藥物，在腫瘤治療領(lǐng)域顯示出了良好的應(yīng)用前景[8]。

近年來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)tubulin在自身免疫病患者有增高的趨勢(shì)。Zheng等[4]通過(guò)反相高效液相色譜(HPLC)及線性離子阱質(zhì)譜分析(linear ion trap-FT-MS)方法研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清中tubulin的水平增高。Kamada通過(guò)二維膠和質(zhì)譜分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)RA患者骨髓源性粘連細(xì)胞(BMACs)的α-tubulin的表達(dá)水平明顯高于OA患者[9]。目前缺乏進(jìn)一步與臨床資料關(guān)系的研究及發(fā)病機(jī)制的探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中α-tubulin水平明顯高于健康對(duì)照，且α-tubulin水平與類風(fēng)濕因子水平、IgA水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，研究結(jié)果提示α-tubulin參與了RA的發(fā)病，但并不提示是一種急性相蛋白，更多的與RA患者免疫反應(yīng)相關(guān)。

關(guān)于tubulin在自身免疫病發(fā)病機(jī)制的作用。已知微管蛋白主要參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成、遷移[10]，而血管炎是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的病理基礎(chǔ)之一。研究者推測(cè)，血管炎可使血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞，微管解聚，α-tubulin釋放入血，可能是構(gòu)成自身免疫病患者血清α-tubulin水平升高的病理機(jī)制之一。

同時(shí)，有學(xué)者提出α-tubulin作為一種自身抗原參與了自身免疫病的發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)，肺移植后出現(xiàn)慢性排斥反應(yīng)患者K-α1 tubulin抗體的水平明顯高于不出現(xiàn)的患者及健康對(duì)照者。且抗K-α1 tubulin抗體的濃度越高，發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)性越高。研究者推測(cè)抗體與氣道表皮細(xì)胞K-α1 tubulin結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子 TCF5和c-Myc,引起纖維源性生長(zhǎng)因子的表達(dá)增高,最終激活細(xì)胞周期及纖維增殖信號(hào)系統(tǒng)，誘發(fā)肺移植后的免疫病理反應(yīng)[11-12]。本研究中，RA患者血清中α-tubulin水平與類風(fēng)濕因子水平、IgA水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步提示了α-tubulin參與了體內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)。

(本文圖1見(jiàn)封三)

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31140008)；首都醫(yī)學(xué)發(fā)展基金項(xiàng)目(首發(fā)-1-4051); 北京醫(yī)院院內(nèi)基金項(xiàng)目(BJ-2014-033)

作者簡(jiǎn)介：程永靜，博士，主任醫(yī)師，Email:mastercheng99@hotmail.com

中圖分類號(hào):R593.22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.03.001

(收稿日期：2016-01-04)

The detection and correlation research of α-tubulin and disease activity parameters in rheumatoid arthritis

ChengYongjing,ZhangChunmei,ChenYingjuan,WangFang,GaoMing,HuangCibo

(DepartmentofRheumatologyandImmunology,BeijingHospital,Beijing100730 ,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect serum α-tubulin in patients with rheumatoid arthritis (RA) and analyze the correlation between serum α-tubulin and clinical, laboratory parameters of RA, provided the theoretical basis to seek the pathogenesis of diseases.MethodsBlood samples from 68 patients with RA,32 patients with Osteoarthritis(OA) and 32 healthy controls were collected. Serum α-tubulin were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Difference of α-tubulin between RA patients,OA patients and healthy controls was analyzed by independent sample t test. Correlation analysis was done between α-tubulin level and clinical, laboratory parameters of RA,including age, disease duration, number of tender joints, number of swelling joints, DAS28 score and levels of ESR, C-reactive protein (CRP), Rheumatoid Factor (RF), immunoglobin G (IgG), immunoglobin A (IgA) and immunoglobin M (IgM). ResultsThe α-tubulin of RAwas obviously higher than that of OA patients and healthy controls (P<0.01). Further analysis demonstrated that α-tubulin level was positively correlated with the disease duration(r=0.307,P=0.023), levels of RF and IgA(r=0.558,P=0.0001; r=0.395,P=0.004). Conclusionα-tubulin may play roles in the development o f RA and may be a potential biomarker of of RA.

[Key words]Arthritis,rheumatoid; Tubulin;Autoimmunity; Immunoglobulins