劉容枝

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京市，100044

結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑注冊申報(bào)資料相關(guān)問題探討

【作者】劉容枝

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京市，100044

結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑是結(jié)核病輔助診斷的重要手段之一，其檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。該文就結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑注冊申報(bào)的三項(xiàng)重要的技術(shù)資料(主要原材料研究資料、分析性能評估資料和臨床試驗(yàn)資料)中的重點(diǎn)問題進(jìn)行探討，以供申報(bào)者參考。

結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑；主要原材料研究資料；分析性能評估資料；臨床試驗(yàn)資料

0 引言

結(jié)核病是影響人類健康的主要傳染病之一，特別是在發(fā)展中國家，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)報(bào)告，我國現(xiàn)有結(jié)核病患者約450萬例，每年死亡近13萬例。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴痰涂片抗酸染色和培養(yǎng)法，結(jié)核血清學(xué)檢測試劑和核酸檢測試劑是結(jié)核病輔助診斷的重要手段。結(jié)核分枝桿菌抗體檢測是結(jié)核血清學(xué)檢測中非常重要的組成部分，可提高涂片陰性結(jié)核病的檢出率以及進(jìn)行鑒別診斷，因此，其檢測的準(zhǔn)確性（敏感性和特異性）至關(guān)重要。

結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑是指利用免疫學(xué)方法（如：酶免疫技術(shù)和膠體金等分析技術(shù)），對人體血清或血漿等樣本中的結(jié)核分枝桿菌抗體進(jìn)行體外定性檢測的試劑，可用于結(jié)核病的輔助診斷。結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑，主要指結(jié)核分枝桿菌IgG和IgM抗體檢測試劑。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑主要為IgG或IgM定性檢測試劑。

1 主要原材料研究資料

主要原材料選擇的合理與否，直接關(guān)系到申報(bào)試劑的性能。因此，申請人應(yīng)對市場進(jìn)行充分調(diào)研后進(jìn)行嚴(yán)格篩選，通過試驗(yàn)驗(yàn)證、選出適合自己研發(fā)平臺的原材料。對于結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑而言，最重要的主要原材料是抗原。

抗原的制備主要包括兩種方式：一種是從病原體中提取目標(biāo)抗原；一種是采用基因工程技術(shù)制備重組抗原。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日趨成熟，基因工程抗原的獲取越來越方便，成本也越來越低；而且，與傳統(tǒng)的病原體制備而來的抗原相比，基因工程抗原的純度相對較高、抗原表位和片段大小的選擇也相對靈活。對于酶標(biāo)板等抗原包被表面積較小的固相載體而言，抗原越小，意味著可包被的有效抗原表位的絕對數(shù)量越多，試劑的靈敏度會提高。而且，許多生產(chǎn)廠家自身就具備生產(chǎn)基因工程重組抗原的技術(shù)平臺。因此，近些年來，基因工程重組抗原頗受體外診斷試劑生產(chǎn)廠家的青睞。

但是，大部分的基因工程重組抗原來源于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，缺少糖基化等真核細(xì)胞中特有的蛋白后修飾過程，因此，與寄生在人體細(xì)胞中的、采用人體細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)修飾的結(jié)核分枝桿菌抗原相比，存在一定的差異。另外，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)除了產(chǎn)生目標(biāo)抗原外，還包括許多自身的其他蛋白，盡管經(jīng)過多種方法分離純化后，得到的目標(biāo)抗原的純度較高，生產(chǎn)廠家仍需要考慮大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可能引入的非特異性反應(yīng)。因此，申請人需廣泛選擇抗原，并采用臨床血清或血漿樣本進(jìn)行試驗(yàn)，篩選與真實(shí)的臨床樣本反應(yīng)性且特異性好的抗原。

一般采用企業(yè)參考品來篩選抗原。企業(yè)參考品的制備，則常采用已上市的至少2家同類試劑檢測臨床血清或血漿樣本，選擇幾種試劑同時(shí)檢測為陰性或陽性的臨床血清或血漿樣本，作為企業(yè)陰性參考品或陽性參考品。陽性參考品應(yīng)包括臨界陽性樣本、中等濃度陽性樣本以及高濃度陽性樣本，覆蓋臨床可能出現(xiàn)的各種程度的樣本，便于選出具有高靈敏度的抗原；同時(shí)，陰性參考品應(yīng)包括可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體抗體陽性的血清或血漿樣本，便于選出具有高特異性的抗原。除此之外，還需選擇合適抗體滴度的臨床陽性樣本作為精密度參考品，以便考核備選抗原的穩(wěn)定性。

申請人在提交此部分資料時(shí)，需詳細(xì)描述抗原選擇過程的各種研究資料以及驗(yàn)證資料。

2 分析性能評估資料

2.1 最低檢出限

已獲批準(zhǔn)的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑均為定性檢測試劑，目前尚無結(jié)核分枝桿菌抗體定量檢測試劑獲準(zhǔn)上市。因此，對于該類試劑的最低檢出限，無法給出絕對濃度。為了確定該類試劑的最低檢出限，一般選取經(jīng)其他已上市的同類試劑確認(rèn)為陽性的、特定滴度的結(jié)核分枝桿菌抗體樣本，做系列倍比稀釋后進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果陽性率在90%以上（n≥20）的最大稀釋倍數(shù)作為申報(bào)試劑的最低檢出限。

2.2 分析特異性

影響申報(bào)試劑特異性的因素主要包括：抗原結(jié)構(gòu)相近或臨床癥狀相似的其他病原體的抗體可能帶來的交叉反應(yīng)；以及臨床樣本本身含有的干擾物質(zhì)和抗凝劑（血漿）可能帶來的干擾。

2.2.1 交叉反應(yīng)

研究抗原結(jié)構(gòu)相近或臨床癥狀相似的其他病原體的抗體對結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑是否存在交叉反應(yīng)。用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體包括但不限于：弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、E-B病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、肺炎支原體、人類免疫缺陷病毒、肺炎鏈球菌等。一般采用已經(jīng)上市的試劑篩選其他病原體抗體陽性、而結(jié)核分枝桿菌抗體陰性的臨床樣本，然后采用申報(bào)試劑檢測這些臨床樣本，如申報(bào)試劑的檢測結(jié)果為陰性，說明其他病原體的抗體對申報(bào)試劑無交叉。

申請人需提交用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體的來源、濃度或滴度確認(rèn)等信息。

2.2.2 干擾實(shí)驗(yàn)

(1) 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

需研究樣本中常見的內(nèi)源性干擾物質(zhì)（總IgG、總IgM、膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗核抗體、類風(fēng)濕因子等）對結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑的干擾情況。常用方法為：采用申報(bào)試劑檢測結(jié)核分枝桿菌抗體陰性的、含有不同濃度干擾物質(zhì)的臨床樣本，以及結(jié)核分枝桿菌抗體弱陽性的（臨界濃度)、含有不同濃度干擾物質(zhì)的臨床樣本，研究不同濃度的干擾物質(zhì)對申報(bào)試劑檢測結(jié)果的影響，確定不影響檢測結(jié)果的干擾物質(zhì)的最高濃度。

(2) 抗凝劑的干擾

如果結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑可用于血漿樣本的檢測，需采用各種適用抗凝劑抗凝的血漿樣本分別與血清樣本進(jìn)行比對實(shí)驗(yàn)研究。常用方法為：檢測至少50例同源的結(jié)核分枝桿菌抗體陰性、弱陽性（略高于臨界值）的血清和血漿樣本（不同抗凝劑各50例），并計(jì)算陰性符合率和陽性符合率，進(jìn)行定性試劑的統(tǒng)計(jì)分析，驗(yàn)證申報(bào)試劑對于血清和血漿樣本檢測結(jié)果的一致性。

對于結(jié)核分枝桿菌IgM抗體檢測試劑而言，還需對至少10份含有結(jié)核分枝桿菌IgM抗體的樣本進(jìn)行IgM破壞研究實(shí)驗(yàn)。常用方法為：采用特定的化學(xué)制劑（如2－巰基乙醇或二硫蘇糖醇）處理含有結(jié)核分枝桿菌IgM抗體的臨床樣本，破壞結(jié)核分枝桿菌IgM抗體的結(jié)構(gòu)后，重新進(jìn)行檢測，申報(bào)試劑的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。

2.3 精密度

精密度試驗(yàn)無約定方法，申請人可根據(jù)自身的研發(fā)平臺確定科學(xué)合理的方法。申請人可參考國內(nèi)或國外的相關(guān)文件進(jìn)行精密度研究。需對每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理的要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。結(jié)核分枝桿菌抗體的精密度評價(jià)主要包括以下要求。

(1)驗(yàn)證申報(bào)試劑檢測過程中的主要變量（如：申報(bào)試劑本身、配套的適用機(jī)型、操作者、地點(diǎn)等要素）對精密度的影響。

(2)設(shè)定合理的周期進(jìn)行精密度評價(jià)。例如：進(jìn)行至少20 d的檢測，每天至少由3人完成不少于3次的檢測，以便對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行評價(jià)。

(3)采用至少以下3個(gè)水平的臨床樣本進(jìn)行精密度的評價(jià)：陰性樣本：結(jié)核分枝桿菌抗體濃度低于申報(bào)試劑臨界值的臨床樣本；弱陽性樣本：結(jié)核分枝桿菌抗體濃度略高于申報(bào)試劑臨界值的臨床樣本；陽性樣本：結(jié)核分枝桿菌抗體濃度呈中到強(qiáng)陽性的臨床樣本。

2.4 鉤狀（HOOK）效應(yīng)

對于采用一步法免疫學(xué)原理的結(jié)核分枝桿菌抗體試劑(比如膠體金法等)，還需研究申報(bào)試劑對含有高濃度結(jié)核分枝桿菌抗體的臨床樣本的檢測能力。常用方法為：系列稀釋含有高濃度結(jié)核分枝桿菌抗體的臨床樣本，然后由低濃度至高濃度進(jìn)行檢測，每個(gè)稀釋度的樣本重復(fù)檢測3～5次，考查申報(bào)試劑是否對高濃度陽性樣本檢出陰性。

3 臨床試驗(yàn)資料

3.1 臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇

應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局資質(zhì)認(rèn)可的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)必須具備與申報(bào)試劑相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員及儀器設(shè)備，并且能夠確保該項(xiàng)試驗(yàn)的實(shí)施。建議申請人選擇結(jié)核病?？漆t(yī)院進(jìn)行臨床試驗(yàn)，同時(shí)考慮臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的地域性，以保證臨床樣本獲取的充足性、臨床數(shù)據(jù)的可溯性以及臨床樣本選取的多樣性和代表性。

3.2 對比試劑的選擇

目前，已有多種結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑獲準(zhǔn)上市。申請人可選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類試劑作為對比試劑進(jìn)行比對研究，證明申報(bào)試劑與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。由于不同企業(yè)的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑包被的抗原可能存在較大差異，建議申請人在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以便從多種已上市試劑中選擇性能相近同時(shí)質(zhì)量較好的對比試劑進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

對于結(jié)核分枝桿菌IgM抗體檢測試劑而言，申請人還需采用申報(bào)試劑檢測不少于30例感染急性期患者的樣本。確定感染急性期的方法包括：病原體分離培養(yǎng)鑒定方法、病原體IgG抗體血清學(xué)轉(zhuǎn)換（動態(tài)監(jiān)測2份或以上的血清IgG，恢復(fù)期與急性期比較IgG呈4倍以上升高）、病原體核酸檢測或直接抗原檢測等方法。提醒注意的是，應(yīng)密切結(jié)合患者的臨床診斷綜合判斷病例是否處于病原體感染的急性期。

3.3 臨床試驗(yàn)樣本的選擇

臨床試驗(yàn)對象的選擇需滿足如下條件：（1）具有結(jié)核病癥狀/體征的疑似結(jié)核患者病例；（2）結(jié)核病的病例需包括一定數(shù)量的肺結(jié)核和肺外結(jié)核病例，并含有適當(dāng)數(shù)量的涂片陰性的結(jié)核病病例，病例的選擇應(yīng)滿足臨床流行病學(xué)的分布特點(diǎn)；（3）應(yīng)包括其他易混淆疾病的病例（比如肺癌、肺炎等），以對申報(bào)試劑的特異性進(jìn)行評價(jià)。

3.4 適用樣本類型同時(shí)包括血清血漿的相關(guān)要求

如果申報(bào)試劑同時(shí)適用于血清和血漿兩種樣本類型，還應(yīng)對至少200例的樣本進(jìn)行血清血漿樣本的同源比對研究。

3.5 臨床原始數(shù)據(jù)的相關(guān)要求

最終納入統(tǒng)計(jì)的所有病例的臨床背景信息（臨床診斷、年齡、性別等）都應(yīng)清晰并具有可追溯性。臨床原始數(shù)據(jù)表應(yīng)包括臨床診斷信息，臨床診斷必須是最終的臨床確診結(jié)果，而不是進(jìn)行簡單癥狀的描述。

結(jié)核病的臨床確診非常復(fù)雜，抗體檢測試劑作為有力的輔助診斷手段，其檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。申請人在研發(fā)此類試劑時(shí)，在進(jìn)行抗原等原材料的篩選時(shí)，就應(yīng)充分考慮這些原材料對產(chǎn)品性能的影響（敏感性和特異性），并在分析性能評估和臨床試驗(yàn)中對其敏感性和特異性進(jìn)行充分的驗(yàn)證。

[1] 黃勝, 余繼英, 趙春艷, 等. 膠體金法檢測結(jié)核抗體的臨床價(jià)值探討[J]. 臨床肺科雜志, 2014, 19(6): 1058-1060.

[2] 劉倩穎, 王心靜, 林明貴. 血清結(jié)核桿菌抗體檢測在結(jié)核病的臨床意義[J]. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2014, 18(7): 1105-1107.

[3] 劉偉. 結(jié)核抗體檢測對結(jié)核疾病的臨床診斷價(jià)值探討[J]. 中國臨床新醫(yī)學(xué), 2015, 8(1): 51-53.

[4] 孟蘇凱, 吳振萍, 張玉華, 等. 血清結(jié)核抗體檢測在結(jié)核病臨床診斷中的價(jià)值[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2015, 25(22): 3858-3860.

[5] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）體外診斷試劑注冊管理辦法[R]. 2014-07-30.

[6] CDRH, FDA, USA. Establishing the performance characteristics of in vitro diagnostic devices for the detection or detection and differentiation of influenza viruses[R]. 2008-02-15.

[7] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局2014年第16號 體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[R]. 2014-09-11.

Study on the Related lssues of the Registration Declaration Information of Mycobacterium Tuberculosis Antibody Detection Kit

【W(wǎng)riter】LIU Rongzhi

Center for Medical Device Evaluation, China Food and Drug Administration(CFDA), Beijing, 100044

Mycobacterium tuberculosis antibody detection kits are used as one important mean of auxiliary diagnosis of tuberculosis, and their detection accuracy is of great concern. Here，we discussed three important technical data of Mycobacterium tuberculosis antibody detection kits registration declaration information (main raw material research, performance evaluation data and clinical test data) , to provide reference for registrants.

Mycobacterium tuberculosis antibody detection kits, main raw material research data, performance evaluation data, clinical test data

F203

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.04.012

1671-7104(2016)04-0279-03

2015-02-04

劉容枝，E-mail: liurz@cmde.org.cn