黃 浩，趙 聰，陳貴堂

(中國(guó)藥科大學(xué)食品質(zhì)量與安全教研室，南京 211198)

食物源蛋白肽鐵配合物的研究進(jìn)展

黃 浩，趙 聰，陳貴堂

(中國(guó)藥科大學(xué)食品質(zhì)量與安全教研室，南京 211198)

綜述食物源蛋白多肽鐵配合物的制備、分離純化、結(jié)構(gòu)分析、生物活性以及安全性研究進(jìn)展。

多肽鐵配合物；補(bǔ)鐵劑；缺鐵性貧血

全球大概有10%～30%的人存在缺鐵狀況，機(jī)體缺鐵會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白合成受阻，從而引發(fā)缺鐵性貧血(IDA)[1]。缺鐵性貧血在人群中發(fā)生情況較為嚴(yán)重的是兒童、孕婦和成年婦女等人[2]。機(jī)體內(nèi)的鐵主要來(lái)源于食物，但食物中的植物性鐵吸收利用率低[3]，因此，補(bǔ)鐵劑在預(yù)防和治療IDA 上有著非常重要的作用。高吸收率、高生物利用率且無(wú)胃腸道副作用的多肽鐵是治療缺鐵性貧血的理想補(bǔ)鐵劑。鐵元素經(jīng)過(guò)配合反應(yīng)后，是通過(guò)配位體的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收系統(tǒng)被機(jī)體吸收的。Ashmead等[4]研究證實(shí)，配合物中心的鐵元素是以整體的形式被小腸絨毛的刷狀緣直接吸收。多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收系統(tǒng)具有能耗較低、轉(zhuǎn)運(yùn)吸收速度較快和不容易被飽和等優(yōu)點(diǎn)[5]，因此，多肽鐵配合物憑借多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收系統(tǒng)，能夠有效提高鐵在機(jī)體內(nèi)的吸收利用率[6]。

利用化學(xué)合成法合成的多肽制備多肽鐵配合物不僅成本高，而且存在化學(xué)物質(zhì)殘留等安全性問(wèn)題[7]，因此，源于天然動(dòng)植物蛋白的多肽具有較高的食用安全性和開(kāi)發(fā)利用潛力。近年來(lái)，關(guān)于多肽鐵配合物的研究報(bào)道中，用于制備多肽鐵配合物的原料主要有大麥蛋白[8]、鷹嘴豆蛋白[9]、低值魚(yú)蛋白[10，11]、豬血蛋白[12，13]、芝麻蛋白[14]、豆粕蛋白[15]、魚(yú)鱗蛋白[16]、烏雞蛋白[17]和魚(yú)皮蛋白[18]等天然動(dòng)植物蛋白。

1 食物源蛋白多肽鐵配合物的制備

1.1 酶解

多肽鐵配合物是將天然動(dòng)植物蛋白酶解后得到的多肽，在一定溫度和pH等條件下與鐵元素經(jīng)配位反應(yīng)得到的一種生物活性物質(zhì)。多肽的制備方法主要有生物酶解法、溶劑提取法和化學(xué)合成法。由于化學(xué)合成法和溶劑提取法存在操作步驟繁瑣、制備成本相對(duì)較高以及化學(xué)物質(zhì)殘留等缺點(diǎn)，所以實(shí)際較少采用。大多數(shù)的研究報(bào)道采用條件更為溫和、制備成本相對(duì)較低和食用更加安全的生物酶解法來(lái)制備多肽鐵配合物。不同的蛋白酶解條件對(duì)后續(xù)的螯合反應(yīng)以及螯合物的生物活性都有一定程度的影響。近年來(lái)的研究報(bào)道大都探索并優(yōu)化了酶解條件，以期獲得螯合能力和生物活性都較強(qiáng)的多肽。尋求最佳酶解工藝的研究，主要集中在最適酶的篩選、酶添加量、酶反應(yīng)時(shí)間、酶反應(yīng)溫度、酶反應(yīng)pH值等影響因素上，并以多肽水解度和肽鐵螯合率為考察指標(biāo)。林慧敏等[10]在帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物的制備中，采用了雙酶法酶解，并探究了酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間和pH等酶解條件。Wu等[11]通過(guò)單酶篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶是制備鳀魚(yú)肌肉蛋白多肽鐵螯合物的最適酶，并且肽鐵螯合率與多肽的水解度有較大的相關(guān)性。潘風(fēng)光等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶是酶解制備豬血多肽鐵配合物的最適酶。汪嬋等[14]在制備芝麻蛋白多肽鐵配合物的研究中發(fā)現(xiàn)，以胰蛋白酶為最適酶，在酶添加量為20 U/g、底物濃度為5%、酶解時(shí)間為5 h的最佳酶解條件下得到的芝麻蛋白多肽與鐵的螯合率可達(dá)90.9%。

1.2 螯合

在多肽與鐵離子的螯合反應(yīng)過(guò)程中，大多是以二價(jià)鐵作為鐵源，鄭炯等[13]研究發(fā)現(xiàn)，二價(jià)鐵中以氯化亞鐵的螯合活性較好。為了避免二價(jià)鐵被氧化，需添加一定量的抗氧化劑，楊華等[15]通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸的抗氧化效果較好。pH值相對(duì)較低的條件下，溶液中的氫離子會(huì)與二價(jià)鐵離子競(jìng)爭(zhēng)多肽中的供電子基團(tuán)；pH值相對(duì)較高的條件下，溶液中的羥基易與二價(jià)鐵離子生成氫氧化鐵沉淀，因此，適宜的pH才能保證螯合反應(yīng)的有效進(jìn)行，由此可見(jiàn)，優(yōu)化多肽與鐵的螯合工藝顯得尤為重要。目前有關(guān)多肽鐵配合物螯合工藝的研究主要集中在pH值、多肽與鐵的質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等影響因素上，并且以肽鐵螯合率和螯合物得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

劉永等[16]在制備羅非魚(yú)鱗膠原蛋白多肽鐵配合物的研究中，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到反應(yīng)時(shí)間為41 min、反應(yīng)溫度為40 ℃、pH值為5.4和肽鐵質(zhì)量比為3∶1的最佳螯合工藝條件。宋莎莎等[17]得到了制備烏雞多肽鐵配合物的最佳工藝條件，即肽濃度為4%、pH值為5、肽鐵質(zhì)量比為5∶1，并在最佳螯合反應(yīng)條件下，測(cè)得螯合物得率為40.27 %、肽鐵螯合率為84.76 %。蔡冰娜等[18]在制備鱈魚(yú)皮膠原蛋白多肽鐵配合物的研究中，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了最佳螯合制備工藝：肽濃度為3.5%、肽鐵質(zhì)量比為4∶1、pH值為7.0。楊華等[15]在以大豆豆粕為原料制備大豆多肽亞鐵配合物的研究中，在反應(yīng)溫度30 ℃、pH值為4.0、肽鐵質(zhì)量比1∶1、反應(yīng)時(shí)間40 min的最佳螯合制備工藝條件下，螯合物得率可達(dá)46.49%、肽鐵螯合率可達(dá)86.60%。

2 食物源蛋白多肽鐵配合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 分離純化

在蛋白酶解過(guò)程中，由于蛋白酶的非專一性，導(dǎo)致了未水解蛋白、氨基酸、多肽和多肽鐵配合物共存于多肽液中。為了進(jìn)一步研究多肽鐵配合物的結(jié)構(gòu)、機(jī)理和活性等，需先進(jìn)行分離純化。利用無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑可以對(duì)螯合產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，然后通過(guò)鹽析法 、親和層析法、反相高效液相色譜法、超濾法、電泳法和凝膠色譜法等進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

Torres-Fuentes等[9]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)親和層析和凝膠色譜法分離純化后的鷹嘴豆蛋白多肽的鐵螯合活性會(huì)增大，而且鐵螯合活性與多肽中組氨酸的含量成正相關(guān)性。Guo等[19]采用親和層析和反相高效液相法對(duì)鱈魚(yú)蛋白多肽鐵配合物進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)其中有一種三肽具有很強(qiáng)的鐵螯合活性。林慧敏等[20]采用超濾法對(duì)帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物進(jìn)行了分級(jí)分離純化，得到了不同分子量的組分。de等[21]對(duì)甘蔗酵母提取物進(jìn)行酶解，得到的多肽與鐵螯合，經(jīng)過(guò)親和層析法分離純化后，多肽鐵配合物中賴氨酸和精氨酸的含量增加。Huang等[22]通過(guò)葡聚糖凝膠色譜和離子交換色譜對(duì)蝦蛋白多肽進(jìn)行分離純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為1～6 ku多肽的鐵螯合能力最強(qiáng)。劉文穎等[23]采用凝膠色譜對(duì)烏雞多肽鐵配合物進(jìn)行分離純化，得到其分子量的分布圖譜。

2.2 結(jié)構(gòu)分析

對(duì)分離純化后的多肽鐵配合物進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析，可以通過(guò)紫外和紅外同時(shí)對(duì)多肽和多肽鐵配合物進(jìn)行光譜分析，比較二者官能團(tuán)吸收光譜的變化以及分析鑒定多肽鐵配合物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；還可采用氨基酸分析儀、質(zhì)譜法以及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等鑒定多肽鐵配合物的分子量、氨基酸組成和序列結(jié)構(gòu)。

黃賽博等[24]對(duì)帶魚(yú)蛋白多肽和螯合后的多肽鐵配合物進(jìn)行了紫外和紅外光譜分析，經(jīng)過(guò)配位反應(yīng)后，紫外光譜分析結(jié)果顯示，氨基酸殘基吸收減小、肽鍵吸收增大，由此可知，螯合反應(yīng)形成了和肽鍵相似的結(jié)構(gòu)；紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，氨基吸收峰向高波方向發(fā)生位移，羰基吸收峰往低波方向發(fā)生位移，更加說(shuō)明亞鐵離子與多肽的氨基和羧基形成了共價(jià)鍵。Lee等[25]通過(guò)液相與電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定了豬血蛋白多肽鐵配合物中多肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。Guo等[26]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定出鱈魚(yú)膠原蛋白經(jīng)胰蛋白酶解后螯合活性較強(qiáng)的10個(gè)多肽的序列結(jié)構(gòu)。張濱等[27]利用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定出豬血蛋白多肽鐵配合物的相對(duì)分子質(zhì)量以及氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

3 食物源蛋白多肽鐵配合物的功能

3.1 多肽鐵是一種優(yōu)良的補(bǔ)鐵劑

補(bǔ)鐵劑主要有無(wú)機(jī)鐵、有機(jī)鐵、氨基酸鐵和多肽鐵。硫酸亞鐵等無(wú)機(jī)鐵較容易和日常飲食中的植酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成難溶性化合物，從而導(dǎo)致其在機(jī)體內(nèi)吸收利用較差[28]。葡萄糖酸亞鐵等有機(jī)鐵比無(wú)機(jī)鐵的吸收利用率稍高，但和無(wú)機(jī)鐵一樣有鐵銹異味和對(duì)胃腸道刺激大。在機(jī)體內(nèi)，氨基酸鐵的吸收利用率是硫酸亞鐵的2倍左右[29]，并且在小腸中直接以螯合物的形式被整體吸收[30]。由于小腸粘膜細(xì)胞上有吸收多肽的載體[31]，多肽鐵可以被腸粘膜細(xì)胞直接吸收進(jìn)入機(jī)體組織，而且與氨基酸相比，多肽的吸收效率更高且不易飽和，例如二肽和三肽的吸收速度高于同一組份的氨基酸[32]。多肽鐵是一種生物態(tài)鐵劑，沒(méi)有胃腸道刺激等副作用和異味，具有高生物利用度和吸收率，且對(duì)缺鐵性貧血有顯著防治效果，故而是一種優(yōu)良的補(bǔ)鐵劑。鄭炯等[33]通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，豬血蛋白多肽鐵配合物可以明顯改善大鼠的缺鐵性貧血，并且其補(bǔ)鐵效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于氯化亞鐵和葡萄糖酸亞鐵。

3.2 多肽鐵的生物活性

3.2.1 免疫活性 補(bǔ)鐵劑在改善機(jī)體缺鐵狀況的同時(shí)，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[34]。馮國(guó)強(qiáng)等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加80、120 mg/ kg甘氨酸亞鐵和160 mg/ kg硫酸亞鐵均能促進(jìn)42日齡肉雞胸腺的發(fā)育；此外，添加 120 mg/kg和160 mg/ kg甘氨酸亞鐵能顯著提高21 d齡肉雞血清免疫球蛋白的含量。王曉玲等[36]通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)研究了多肽鐵配合物的免疫活性，將不同濃度的帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物加進(jìn)小龍蝦的飼料中，在帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物的濃度為200 mg/kg和400mg/kg的條件下喂養(yǎng)30d后，發(fā)現(xiàn)小龍蝦的生長(zhǎng)性能指標(biāo)和非特異性免疫酶的活力并無(wú)明顯提高；在800mg/kg以上的高濃度條件下喂養(yǎng)60 d后，發(fā)現(xiàn)小龍蝦的生長(zhǎng)性能和非特異性免疫酶活力等均明顯增強(qiáng)。

3.2.2 抗氧化活性 鐵是機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化氫酶等含鐵酶類的重要組成成分，有研究表明有些多肽存在抗氧化活性，這些多肽與鐵螯合后能夠保留一定程度的活性，如抗氧化活性[37]。呂瑩等[38]研究發(fā)現(xiàn)，核桃肽與鐵螯合活性越大，其抗氧化能力也會(huì)越強(qiáng)，這可能是亞鐵離子與多肽中的酪氨酸和組氨酸等結(jié)合，而這些氨基酸對(duì)多肽鐵配合物的抗氧化起著重要作用[39]。林慧敏等[40]研究發(fā)現(xiàn)，梅童魚(yú)蛋白多肽鐵配合物清除羥自由基的作用較強(qiáng)，而馬鮫魚(yú)蛋白多肽鐵配合物清除DPPH自由基的作用較強(qiáng)。此外，Cian等[41]研究發(fā)現(xiàn)，紅藻蛋白多肽鐵配合物同時(shí)具有抗氧化和防齲齒活性。汪學(xué)榮等[42]研究發(fā)現(xiàn)，豬血多肽鐵配合物的抗氧化能力強(qiáng)于豬血多肽而弱于維生素C，并且豬血多肽鐵配合物清除過(guò)氧化氫和超氧陰離子的能力都很強(qiáng)。謝超等[43]將帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物經(jīng)不同濃度的無(wú)水乙醇沉淀，研究顯示，抗氧化能力最強(qiáng)的是經(jīng)50%無(wú)水乙醇沉淀獲得的組分。

3.2.3 抗菌活性 不同來(lái)源的多肽鐵配合物具有不同程度的抗菌活性，其抗菌譜也并不相同。帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物對(duì)枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等都具有一定的抑制作用，具有較為廣譜的抗菌活性，尤其對(duì)巨大芽胞桿菌的抑制效果最佳[44]。謝超等[43]將帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物經(jīng)不同濃度的無(wú)水乙醇沉淀，研究顯示，抑菌能力最強(qiáng)的是經(jīng)80%無(wú)水乙醇沉淀得到的組分，且具有較為廣譜的抗菌活性。林慧敏等[40]研究發(fā)現(xiàn)，馬鮫魚(yú)蛋白多鐵配合物沒(méi)有明顯的抗菌活性，而帶魚(yú)蛋白多肽鐵配合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌都存在明顯的抑菌能力。

4 食物源蛋白多肽鐵配合物的安全性評(píng)價(jià)研究

多肽鐵配合物作為一類新的補(bǔ)鐵劑，需科學(xué)地評(píng)價(jià)其食用的安全性。汪學(xué)榮等[45]通過(guò)小鼠急性毒性和大鼠喂養(yǎng)30 d的試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)豬血多肽鐵配合物的安全性，結(jié)果表明小鼠在灌喂豬血多肽鐵配合物后無(wú)明顯的毒性反應(yīng)，喂養(yǎng)30 d后大鼠的血液生化指標(biāo)、行為活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育都表現(xiàn)為正常。王麗霞等[46]研究發(fā)現(xiàn)，豬血多肽鐵配合物和Na-Fe-EDTA均能顯著改善缺鐵性貧血狀況，而且豬血多肽鐵配合物的療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于Na-Fe-EDTA；此外，給小鼠不斷灌胃大劑量的豬血多肽鐵配合物后，小鼠的行為活動(dòng)表現(xiàn)依舊正常，臟器也不存在異常。因此，多肽鐵配合物作為優(yōu)良的補(bǔ)鐵劑長(zhǎng)期口服安全有效，不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用。

5 結(jié)論

目前，食物源蛋白多肽鐵配合物的研究主要集中在制備工藝條件的優(yōu)化以及生物活性研究，有關(guān)食物源蛋白多肽鐵配合物的安全性研究報(bào)道較少，且其活性機(jī)制不清楚，以后有必要深入研究其生物活性與內(nèi)在結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。后續(xù)研究重點(diǎn)不僅可以優(yōu)化制備工藝和研究活性機(jī)理，而且可以將更多不同來(lái)源的動(dòng)植物，特別是食品加工下腳料應(yīng)用于多肽鐵配合物的研究中，提高資源的綜合利用率。隨著后續(xù)研究的不斷深入以及相應(yīng)技術(shù)的發(fā)展，食物源蛋白多肽鐵配合物勢(shì)必將發(fā)揮出其巨大的潛力?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李燕妮)

Research Progress of Polypeptide Iron Chelate from Food Protein

HUANG Hao，ZHAO Cong，CHEN Gui-tang

(Department of Food Quality and Safety，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

This paper reviewed research progress on the preparation，separation and purification，structural analysis，biological activity and safety of polypeptide iron chelate from food protein.

polypeptide iron chelate；iron supplement；iron deficiency anemia(IDA)

中國(guó)藥科大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2016ZZD001)。

黃浩(1993— )，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品學(xué)。

陳貴堂(1977— )，男，博士，副教授，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。