汪晶晶，王 琦，王軍強(qiáng)，顧春霞，暴增海*，馬桂珍，王淑芳，賈 杰

(1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005；2.宣化縣第二中學(xué)，河北 宣化 075100； 3.江蘇耕耘化學(xué)有限公司，江蘇 連云港 222005)

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海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1變異菌株的特性及其抑菌作用研究

汪晶晶1，王 琦1，王軍強(qiáng)1，顧春霞2，暴增海1*，馬桂珍1，王淑芳1，賈 杰3

(1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005；2.宣化縣第二中學(xué)，河北 宣化 075100； 3.江蘇耕耘化學(xué)有限公司，江蘇 連云港 222005)

為了明確海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1自發(fā)突變菌株的變異與抗菌作用的關(guān)系，進(jìn)一步獲得優(yōu)良菌種，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA和gyrB基因序列分析，對(duì)變異菌株GM-1-2特性進(jìn)行分析；以8種植物病菌為供試菌，采用平板對(duì)峙法和牛津杯法分別測(cè)定變異菌株GM-1-2及其發(fā)酵液的抑菌作用；采用硫酸銨沉淀法對(duì)變異菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變異菌株GM-1-2的菌落形態(tài)、顏色、菌體大小與原始菌株GM-1存在明顯差異，但其生理生化特性、16S rDNA和gyrB序列與解淀粉芽孢桿菌的同源性等均與原始菌株相同。變異菌株GM-1-2及其發(fā)酵液對(duì)小麥根腐病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、大豆菌核病菌、小麥雪腐病菌、甘藍(lán)枯萎病菌、斑點(diǎn)落葉病菌、黃瓜枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制作用，且抑制作用明顯高于原始菌株GM-1，其中菌株的抑菌帶寬度提高了0.2～9.0 mm，無(wú)菌發(fā)酵液的抑制率提高了1.1%～153.7%。變異菌株的抑菌物質(zhì)主要存在于硫酸銨沉淀中，沉淀后的上清液無(wú)明顯的抑菌作用。以上結(jié)果表明，變異菌株GM-1-2的抑菌活性提高，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)與原始菌株存在差異，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

海洋解淀粉芽孢桿菌； 變異菌株； 16S rDNA；gyrB基因； 抑菌作用

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢桿菌屬中的一個(gè)種，在1980年之前鮮有報(bào)道，1987年P(guān)riest等[1]發(fā)現(xiàn)并建立了解淀粉芽孢桿菌模式菌株ATCC23350。2007年公布了解淀粉芽孢桿菌FZB42的全基因組序列，基因組全長(zhǎng)3 918 kb，包含3 693個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列[2]。一些學(xué)者從多種植物及土壤中分離到對(duì)半裸鐮刀菌(Fusariumsemitectum)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、人參銹腐病菌(Cylindrocarpondestructans)、人參黑斑病菌(Alternariabrassicicola)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)等多種植物病原菌有較強(qiáng)抑制作用的解淀粉芽孢桿菌[3-9]，美國(guó)Taegro公司已研發(fā)出商品化的解淀粉芽孢桿菌 FZB42菌劑，主要用于防治農(nóng)作物的枯萎病和根腐病[10]。

已有報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌主要來(lái)自陸源，有關(guān)來(lái)自海洋的解淀粉芽孢桿菌的研究較少。淮海工學(xué)院抗菌微生物及其代謝產(chǎn)物研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從連云港海域海水中分離得到1株對(duì)多種植物病原真菌有較強(qiáng)抑制作用的海洋解淀粉芽孢桿菌菌株GM-1，并對(duì)該菌株的抑菌作用、發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[11-13]。在對(duì)該菌株的研究與應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)連續(xù)多代培養(yǎng)，出現(xiàn)了與原始菌落形態(tài)不同的菌落，分離純化后作為變異菌株記為GM-1-2，該菌株經(jīng)多代連續(xù)培養(yǎng)特性穩(wěn)定。本試驗(yàn)對(duì)變異菌株GM-1-2的特性和抑菌作用進(jìn)行研究，旨在明確菌株的變異與抗菌作用的關(guān)系，為進(jìn)一步獲得優(yōu)良菌種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海洋細(xì)菌GM-1為淮海工學(xué)院抗菌微生物及其代謝產(chǎn)物研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從連云港海域分離得到；變異菌株GM-1-2由菌株GM-1自發(fā)突變得到。供試植物病原菌為小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、大豆菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麥雪腐病菌[Fusariumnivale(Fr)Ces]、甘藍(lán)枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Conglutinans)、斑點(diǎn)落葉病菌(Alternariaalternate)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Cucumerinum)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株GM-1、GM-1-2菌體活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。菌株GM-1、GM-1-2種子和發(fā)酵用培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L、牛肉膏16 g/L、酵母膏3 g/L、FeSO40.4 g/L、水1 000 mL，pH值7.0[12]。

1.1.3 試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州寶賽生物科技有限公司；2K DNA Marker、2×EasyTaqSuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；10×Loading Buffer為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 變異菌株形態(tài)特征觀(guān)察 將變異菌株GM-1-2 和原始菌株GM-1分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀(guān)察記錄菌落形態(tài)、顏色，進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色以及莢膜染色，比較變異菌株GM-1-2 和原始菌株GM-1形態(tài)的異同點(diǎn)。液體PD培養(yǎng)觀(guān)察：將培養(yǎng)24 h的GM-1-2菌株斜面加入適量無(wú)菌水，制成109cfu/mL的菌懸液，按10%接種量接入到裝有60 mL PD培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，觀(guān)察培養(yǎng)液顏色等。

1.2.2 變異菌株生理生化試驗(yàn) 生理生化試驗(yàn)參考布坎南等《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]和東秀珠等《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]中的方法，主要測(cè)定M.R.試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、半固體瓊脂穿刺試驗(yàn)、明膠液化等生理生化指標(biāo)，并與原始菌株進(jìn)行比較。

1.2.3 變異菌株16S rDNA序列分析 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA。16S rDNA基因PCR擴(kuò)增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：模板(變異菌株GM-1-2 和原始菌株GM-1的總DNA)1.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序，序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較，采用MEGA 5軟件包以鄰接法(Neighbour-Joining，bootstrap 500)進(jìn)行序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。比較變異菌株GM-1-2 和原始菌株GM-1的16S rDNA序列。

1.2.4 變異菌株gyrB序列分析gyrB基因PCR引物為UP-1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGGNGGNAARTTYGA-3′)和UP-2 (5′-AGCAGGCTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCKTCNGTCAT-3′)；擴(kuò)增體系(25 μL)：模板(變異菌株GM-1-2 和原始菌株GM-1的總DNA)1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件、PCR產(chǎn)物測(cè)序、序列同源性分析、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等方法同1.2.3。

1.2.5 變異菌株對(duì)植物病原真菌的抑制作用測(cè)定 采用平板對(duì)峙法。在PDA培養(yǎng)基平板中央接種直徑為8 mm的植物病原菌菌苔，在菌苔周?chē)嚯x培養(yǎng)皿邊緣1.5 cm處劃線(xiàn)接種拮抗菌株，重復(fù)3次，于28 ℃倒置恒溫培養(yǎng)4～5 d，測(cè)定抑菌帶寬度，比較變異菌株GM-1-2與原始菌株GM-1的抑菌作用。

1.2.6 變異菌株發(fā)酵液對(duì)植物病原真菌的抑制作用測(cè)定

1.2.6.1 種子液與無(wú)菌發(fā)酵液的制備 采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法。將活化的GM-1-2菌株斜面用適量無(wú)菌水洗下，制成109cfu/mL的菌懸液，按10%接種量接入裝有60 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，即為種子液。按10%的接種量，將種子液接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)60 h，得到發(fā)酵液，10 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵液。

1.2.6.2 抑菌作用測(cè)定 采用牛津杯法。在平板中央分別接入8 種不同種類(lèi)的植物病原真菌菌苔(直徑8 mm)，在病原菌周?chē)嚯x平板邊緣10 mm處等距離放置牛津杯，取無(wú)菌濾液200 μL加入牛津杯中，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d。以無(wú)菌水為對(duì)照，每種病原真菌為1個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，比較變異菌株與原始菌株發(fā)酵液的抑菌作用。

抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌苔直徑)×100%。

1.2.7 變異菌株發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的初步定位 冰浴條件下分別在200 mL的變異菌株GM-1-2和原始菌株GM-1發(fā)酵液中加入硫酸銨粉末，使飽和度達(dá)到80%，攪拌2 h，硫酸銨全部溶解后放入4 ℃冰箱過(guò)夜。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液與沉淀，用10 mL PBS溶解沉淀，將沉淀與上清透析后，分別檢測(cè)上清液和沉淀的抑菌活性，方法同1.2.6。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 變異菌株GM-1-2的形態(tài)特征

在PDA平板上培養(yǎng)24 h，原始菌株GM-1菌落呈乳黃色，而變異菌株GM-1-2菌落為乳白色；變異菌株GM-1-2菌落表面干燥有褶皺，原始菌株GM-1菌落表面濕潤(rùn)光滑。PD培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，變異菌株與原始菌株的培養(yǎng)液顏色存在較大差異，變異菌株GM-1-2培養(yǎng)液呈橘紅色，而原始菌株GM-1培養(yǎng)液呈黃褐色。

變異菌株GM-1-2與原始菌株GM-1菌體形態(tài)無(wú)差異，細(xì)胞呈桿狀，G+，單個(gè)排列，也有鏈狀排列，有芽孢、中生，極生單鞭毛；培養(yǎng)16 h變異菌株GM-1-2和原始菌株GM-1細(xì)胞大小分別為(1.73±0.22)μm×(0.64±0.07)μm和(2.00±0.22)μm×(0.65±0.05)μm，變異菌株GM-1-2細(xì)胞略小于原始菌株GM-1。說(shuō)明變異菌株與原始菌株在菌落形態(tài)、顏色以及細(xì)胞大小等方面有所差異。

2.2 變異菌株GM-1-2生理生化試驗(yàn)結(jié)果

變異菌株GM-1-2可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等糖醇進(jìn)行發(fā)酵，不能利用鼠李糖、阿拉伯糖、麥芽糖、半乳糖、肌醇、山梨醇；V.P.試驗(yàn)、精氨酸雙水解肉湯試驗(yàn)、賴(lài)氨酸脫羧酶肉湯試驗(yàn)呈陽(yáng)性，M.R.試驗(yàn)、苯丙氨酸試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)呈陰性；在7% NaCl條件下可生長(zhǎng)，具有運(yùn)動(dòng)性；在大分子試驗(yàn)中，Tween 80降解試驗(yàn)、明膠液化和淀粉水解試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)均顯陽(yáng)性。變異菌株GM-1-2與原始菌株GM-1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果相同。

2.3 變異菌株GM-1-2 16S rDNA序列分析

以變異菌株GM-1-2的基因組DNA為模板，利用16S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 452 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與原始菌株GM-1相同。將序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，變異菌株GM-1-2與解淀粉芽孢桿菌(KC692163.1)相似度達(dá)到98%。選取GenBank中相似度較高的模式菌株序列以及原始菌株GM-1 16S rDNA序列，采用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，變異菌株GM-1-2與GM-1 16S rDNA相似度達(dá)到99%，二者與解淀粉芽孢桿菌聚在同一分支(圖1)。說(shuō)明變異菌株的16S rDNA基因序列未發(fā)生明顯改變。

圖1 基于16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 變異菌株GM-1-2gyrB序列分析

以變異菌株GM-1-2的基因組DNA為模板，利用gyrB基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 229 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其序列與原始菌株GM-1gyrB基因序列相似度達(dá)到99%。BLAST結(jié)果表明，變異菌株GM-1-2gyrB基因序列與解淀粉芽孢桿菌(JN859131.1)的相似度達(dá)到98%。采用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以發(fā)現(xiàn)變異菌株GM-1-2、原始菌株GM-1和解淀粉芽孢桿菌位于同一分支上(圖2)。說(shuō)明變異菌株的gyrB基因序列未發(fā)生明顯改變。

圖2 基于gyrB 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 變異菌株GM-1-2對(duì)幾種植物病原真菌的抑制作用

從表1可以看出，變異菌株GM-1-2對(duì)8種供試植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌帶寬度為14.0～37.7 mm，較原始菌株提高0.2～9.0 mm。與原始菌株相比，其對(duì)小麥雪腐病菌、甘藍(lán)枯萎病菌、斑點(diǎn)落葉病菌、黃瓜枯萎病菌的抑制作用極顯著提高，抑菌帶寬度增加22.2%～47.9%；另外，其對(duì)小麥根腐病菌和大豆菌核病菌的抑制作用也顯著提高。

表1 變異菌株GM-1-2對(duì)8種植物病原菌的抑菌帶寬度 mm

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.6 變異菌株GM-1-2發(fā)酵液對(duì)幾種植物病原真菌的抑制作用

從表2可以看出，變異菌株GM-1-2發(fā)酵液對(duì)8種供試植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)小麥根腐病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)到61.19%，對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用最弱，抑制率為20.03%。菌株GM-1-2發(fā)酵液對(duì)8種植物病原真菌的抑制作用明顯高于原始菌株，抑制率提高了1.1%～153.7%，其中對(duì)除斑點(diǎn)落葉病菌外的7種植物病原菌的抑制作用與GM-1相比均達(dá)到了極顯著差異水平。

表2 變異菌株GM-1-2無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)8種植物病原菌的抑制率 %

2.7 變異菌株與原始菌株發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的初步定位

經(jīng)硫酸銨沉淀、透析后的原始菌株GM-1發(fā)酵上清液和沉淀對(duì)小麥根腐病菌均具有明顯的抑菌活性(圖3)，抑菌率分別為58.91%、41.36%；變異菌株GM-1-2沉淀的抑菌活性更明顯(圖4)，抑菌率達(dá)到66.10%，而上清液無(wú)明顯的抑菌作用。據(jù)此初步認(rèn)為變異菌株GM-1-2與原始菌株GM-1所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有所不同。

圖3 原始菌株GM-1發(fā)酵液硫酸銨沉淀后沉淀(a)與上清液(b)對(duì)小麥根腐病菌的抑菌作用

圖4 變異菌株GM-1-2發(fā)酵液硫酸銨沉淀后沉淀(a)與上清液(b)對(duì)小麥根腐病菌的抑菌作用

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，變異株菌GM-1-2在菌落形態(tài)、PD培養(yǎng)液顏色等方面與原始菌株GM-1存在顯著差異，但其生理生化試驗(yàn)結(jié)果、16S rDNA 序列和gyrB基因序列與原始菌株基本一致，未發(fā)生明顯改變；變異菌株GM-1-2及其發(fā)酵液對(duì)8種植物病原菌的抑菌活性高于原始菌株GM-1，同時(shí)變異菌株GM-1-2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可以被80%飽和度的硫酸銨沉淀，與原始菌株明顯不同，說(shuō)明變異菌株所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)特性和作用機(jī)制有所不同。解淀粉芽孢桿菌是一類(lèi)重要的生防菌，在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生一系列的抗菌物質(zhì)，如抗菌蛋白[16]、β-1,3-葡聚糖酶[17]、伊枯草菌素A[18]、表面活性素[19]、類(lèi)細(xì)菌素[20]等。有關(guān)原始菌株GM-1和變異菌株GM-1-2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì)，以及抗菌物質(zhì)的純化等研究工作正在進(jìn)行。

田黎等[21]對(duì)微生物產(chǎn)色素機(jī)制進(jìn)行了多年的研究，結(jié)果表明，微生物產(chǎn)色素的功能很不穩(wěn)定，受到營(yíng)養(yǎng)、溫度等外界條件變化的影響。變異菌株GM-1-2在PDA培養(yǎng)基與PD培養(yǎng)液上培養(yǎng)24 h產(chǎn)生的色素明顯不同，PDA培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，而PD培養(yǎng)液中培養(yǎng)呈橘紅色，推測(cè)可能與培養(yǎng)基成分有關(guān)，這一問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

提高或改善原始菌株的功能，主要通過(guò)篩選變異菌株或轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)。芽孢桿菌菌株的自然突變率一般較低，突變幅度較小，通過(guò)自發(fā)突變獲得功能改善突變菌株的概率較小，因而獲得突變菌株的最有效途徑是誘變。賈珂等[22]采用N+注入誘變獲得芽孢桿菌B006 的突變株B841、B73，其表面活性素產(chǎn)量比野生菌株B006 分別升高15.9%、14.8%；薛林貴等[23]經(jīng)2次重離子輻射誘變處理芽孢桿菌屬菌株G-41，獲得突變菌株15Gy-54，其產(chǎn)堿性蛋白酶活力比原始菌株G-41提高了2.65倍。由于通過(guò)自發(fā)突變使原始菌株功能改善的概率較低，有關(guān)自發(fā)突變菌株提高抑菌作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。田成麗等[24]采用繼代培養(yǎng)法選育出6株與原始芽孢桿菌菌株Snea253在菌落形態(tài)、顏色方面均有明顯差異的自發(fā)突變菌株，但6株突變株的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性均顯著低于原始菌株。本研究中變異菌株GM-1-2對(duì)8種植物病原菌的抑制作用明顯高于原始菌株GM-1，此結(jié)果對(duì)于優(yōu)良抗菌菌株的篩選和應(yīng)用具有一定的價(jià)值。

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Studies on Characteristics and Antibacterial Activity of Mutant Strain of MarineBacillusamyloliquefaciensGM-1

WANG Jingjing1,WANG Qi1,WANG Junqiang1,GU Chunxian2,BAO Zenghai1*, MA Guizhen1,WANG Shufang1,JIA Jie3

(1.Jiangsu Marine Resources Development Research Institue,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China; 2.Xuanhua Second Middle School,Xuanhua 075100,China; 3.Jiangsu Frey Agrochemicals Co.,Ltd.,Lianyungang 222005,China)

To make sure of the relationship between the mutation and antibacterial effect ofBacillusamyloliquefaciensGM-1 spontaneous mutants and further obtain excellent strains,such methods as morphology observation of colony,physiological and biochemical reactions,16S rDNA gene andgyrBgene sequences analysis,were applied for the properties analysis of GM-1-2 mutant.Cylinder-plate method and flat-stand method were used to evaluate the antagonistic effects on 8 plant pathogens of GM-1-2 mutant and its fermentation liquid,respectively.The antagonistic substances of GM-1-2 mutant were preliminarily studied by ammonium sulfate precipitation method.The results showed that there were obvious differences between the mutant and the original strain in the colony morphology,color and cell size.However,no obvious differences were found in the physiological and biochemical reactions and genes (16S rDNA andgyrB) sequences.The mutants showed high inhibitory effectsonBipolarissorokiniana,VerticilliumdahliaeKleb,Fusariumgraminearum,Sclerotiniasclerotiorum,Fusariumnivale(Fr)Ces,Fusariumoxysporumf.sp.Conglutinans,Alternariaalternate,Fusariumoxysporumf.sp.Cucumerinum.Antibacterial activities of the mutant and its fermentation broth were higher than the original strain and its fermentation broth,respectively.The inhibition zone diameter of the mutant increased by 0.2—9.0 mm and the inhibition rate of the fermentation liquid increased by 1.1%—153.7%.The antibacterial substances of the mutant mainly appeared in the ammonium sulfate precipitation,and the supernatant after precipitation had no obvious inhibitory effects.In a word,the spontaneous mutant GM-1-2 produced different antibacterial substances from the original strain GM-1 and showed higher antibacterial activity,which had potential development value.

marineBacillusamyloliquefaciens; mutant strain; 16S rDNA;gyrBgene; antibacterial activity

2016-05-15

江蘇省科技廳現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)示范類(lèi)項(xiàng)目(BE2016335)；連云港市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(CN1307)；連云港市“521人才工程”項(xiàng)目

汪晶晶(1991-)，女，江蘇連云港人，在讀碩士研究生，研究方向：抗菌海洋微生物及其代謝產(chǎn)物的研究利用。 E-mail：763041067@qq.com

*通訊作者：暴增海(1962-)，男，河北滄州人，教授，碩士，主要從事植物病害生物防治研究。 E-mail：baozh2008@aliyun.com

S476.1

A

1004-3268(2016)11-0065-06