張運峰

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

?

熱激對玉米大斑病菌Stste12基因沉默突變體發(fā)育的影響

張運峰

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

為了探明溫度升高對玉米大斑病菌Stste12基因沉默突變體生長發(fā)育、基因表達水平等方面的影響，對玉米大斑病菌野生型菌株Wt01-23和Stste12基因沉默突變體StRNAi9-10同時進行熱激處理，比較2個菌株菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、菌落生長速度及分生孢子產(chǎn)量方面的差異，并通過半定量PCR技術(shù)檢測熱激處理對Stste12基因表達的影響。結(jié)果顯示，熱激處理提高了突變體StRNAi9-10菌落的生長速度，其菌落形態(tài)和生長速度接近Wt01-23菌株，但對Wt01-23菌落的生長速度和形態(tài)無顯著影響；半定量PCR檢測顯示，StRNAi9-10在熱激處理后Stste12基因表達量增加，且隨著溫度的升高而增加，而Wt01-23菌株的Stste12基因表達量未發(fā)生顯著變化。以上結(jié)果表明，熱激處理恢復(fù)了玉米大斑病菌RNAi突變體的生理特征，具有抑制RNAi的作用。

熱激; 玉米大斑病菌; 發(fā)育;Stste12; 半定量PCR

玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)屬無性菌亞門凸臍蠕孢屬，其有性態(tài)學(xué)名為Setosphaeriaturcica,稱大斑剛毛座腔菌,屬子囊菌亞門座囊菌目[1]。玉米大斑病菌可以引起玉米葉部病害玉米大斑病，在流行年份可造成玉米減產(chǎn)50%以上[2]。目前，在植物病菌中發(fā)現(xiàn)了3條與生長發(fā)育和致病性有關(guān)的信號途徑:Ca2+途徑、cAMP途徑和MAPK(mitogen-activated protein kinase，促分裂原活化蛋白激酶)途徑，其中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究最為深入[3-5]，分為Fus3/Kss1-homolog途徑、Slt2-homolog途徑和Hog1-homolog MAP kinase途徑3類保守途徑，其中Fus3/Kss1-homolog途徑又稱PMK 信號途徑(pathogenicity MAPK Cascade)，主要通過轉(zhuǎn)錄因子STE12影響病菌附著胞等侵染結(jié)構(gòu)的形成，從而調(diào)控病菌的致病性。STE12首先在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中被發(fā)現(xiàn)，其作為Fus3/Kssl MAPK 途徑的底物，調(diào)控釀酒酵母的交配反應(yīng)、假菌絲的發(fā)育及侵入生長[6]。目前，已經(jīng)在植物病原真菌中發(fā)現(xiàn)了很多STE12-like轉(zhuǎn)錄因子，它們主要參與調(diào)控病菌的侵染過程和有性發(fā)育，進而影響病菌的致病性[7-8]。吳敏[9]研究中獲得了玉米大斑病菌的STE12-like基因Stste12，并構(gòu)建了Stste12基因沉默突變體StRNAi 9-10。

熱激反應(yīng)是細胞和生物體對熱刺激的一種保守性反應(yīng)，亞致死劑量的熱激誘發(fā)熱激反應(yīng)，對細胞或生物體有積極的保護作用[10]。近年來，隨著全球氣溫的升高，頻繁出現(xiàn)的極端天氣已經(jīng)開始影響生物的生長和發(fā)育，例如，Milus等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高溫會使小麥條銹病菌生長速度增快、產(chǎn)孢量增大。Zhong等[12]對擬南芥的研究顯示，溫度升高能夠恢復(fù)擬南芥NRG1 RNAi(RNA interference，RNA干涉)突變體的生長和形態(tài)建成。雖然RNAi技術(shù)廣泛用于生物的基因功能研究，在植物病原真菌中用于弱毒力菌株的培育，但是，在真菌中還沒有關(guān)于高溫環(huán)境對RNAi效應(yīng)影響的研究報道。

本研究通過對玉米大斑病菌野生型菌株Wt01-23及其Stste12沉默突變體StRNAi9-10進行熱激處理，比較了Wt01-23 和StRNAi9-10的菌落形態(tài)、生長速度、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢量，并利用半定量PCR技術(shù)檢測Stste12基因的表達情況，分析熱激處理對玉米大斑病菌形態(tài)發(fā)育和Stste12基因表達的影響，這對于進一步了解玉米大斑病菌生長發(fā)育的調(diào)控機制和控制該病菌的危害將具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 玉米大斑病菌野生型菌株Wt01-23及其Stste12基因RNAi突變體菌株StRNAi9-10由唐山師范學(xué)院植物病理學(xué)實驗室保存。

1.1.2 試劑 UNIQ-10 柱式 Trizol總 RNA 抽提試劑盒購于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶Revest Trascriptase M-MLV和rTaq DNA聚合酶購自Takara公司。用于試驗的引物β-tubulin-L(5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′)、β-tubulin-R(5′-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC -3′)及Stste12基因半定量擴增的引物RTste12-F(5′-GTAGAGACGTAGCCCGTCATCTGG-3′)、RTste12-R(5′-CTCTACCAGATTTTGCGTGGGCTGA-3′)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。DEPC、瓊脂糖、無水乙醇、異丙醇、葡萄糖、Tris、冰醋酸、EDTA和瓊脂粉等試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 菌株的熱激處理 首先以PDA培養(yǎng)基活化玉米大斑病菌菌株Wt01-23和StRNAi9-10，然后用打孔器取菌盤(直徑6 mm)接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，之后對Wt01-23和StRNAi9-10進行45 ℃熱激15 min的處理；每隔24 h熱激處理1次，直至菌株滿皿；每個處理3皿，以25 ℃培養(yǎng)的菌株作為對照。

1.2.2 菌落生長速度的測定 采用十字交叉法測量，每隔24 h測定菌落直徑，直至菌落滿皿。以3次重復(fù)試驗的平均值為每次測量的菌落直徑，采用SPSS方差分析軟件對菌落生長速度進行差異顯著性分析[13]。

1.2.3 菌絲和菌落的形態(tài)觀察 熱激處理后觀察、記錄對照和熱處理菌株菌絲和菌落形態(tài)變化，并進行分析。

1.2.4 分生孢子計數(shù) 分生孢子的計數(shù)按如下方法進行：待玉米大斑病菌長滿培養(yǎng)皿后，向其中滴加適量蒸餾水，然后用毛筆刮下菌絲及分生孢子并制成菌液，過濾后棄去菌絲，5 000 r/min離心10 min，棄去上清后加入0.5 mL蒸餾水，然后用血球計數(shù)板對分生孢子進行觀察計數(shù)，結(jié)果用SPSS軟件進行差異顯著水平分析。

1.2.5 熱激處理對Stste12基因表達的影響測定

1.2.5.1 玉米大斑病菌不同溫度下的熱激處理 Wt01-23和StRNAi9-10菌株的處理參照1.2.1，將每次熱激的溫度設(shè)定為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃。

1.2.5.2 玉米大斑病菌總RNA的提取及第一鏈cDNA合成 按照 UNIQ-10 柱式 Trizol總RNA抽提試劑盒說明書提取玉米大斑病菌總RNA，按照張鑫等[14]的方法利用Oligo(dT)18合成第一鏈cDNA。

1.2.5.3Stste12基因表達的半定量分析 分別以Wt01-23和StRNAi9-10熱激處理后的第一鏈 cDNA 為模板，按下列條件進行 PCR 擴增。25 μL 擴增體系中含有10 μmol/L的β-tubulin-R和β-tubulin-F(或 RTste12-F和 RTste12-R)各1 μL、dNTP Mix(各 2.5 mmol/L) 2 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL、cDNA 20 ng，加入ddH2O 至25 μL；經(jīng)過94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，計 30個循環(huán)的反應(yīng)。取3 μL PCR 擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上以3 V/cm進行電泳檢測。利用 Quantity One(Bio-Rad)分析擴增條帶(內(nèi)標)的亮度值，以內(nèi)標亮度值確定cDNA的模板量，分析熱激條件下Stste12基因表達量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱激對Wt01-23和StRNAi9-10菌落形態(tài)和生長速度的影響

熱激處理后，Wt01-23菌株的菌落形態(tài)呈灰色、規(guī)則圓形，中心部分菌絲成簇生長，靠近邊緣的菌絲蓬松，與對照組的菌落形態(tài)無顯著差異；而熱激處理后的StRNAi9-10菌株菌落顏色、形態(tài)及菌絲生長形態(tài)與Wt01-23菌株相近，且靠近邊緣的菌絲蓬松，與該菌株對照組菌落不規(guī)則的生長形態(tài)差異明顯(圖1A)。通過比較2種菌株熱激處理組和對照組的生長速度可以發(fā)現(xiàn)，熱激處理對Wt01-23無顯著影響；而StRNAi9-10菌株在熱激處理后，生長速度從第3天開始高于對照組，第7天起StRNAi9-10菌株的生長速度顯著高于對照組，接近Wt01-23的生長速度(圖1B)。試驗結(jié)果表明，熱激處理顯著提高了StRNAi9-10菌株的生長速度，恢復(fù)了該菌株的形態(tài)和發(fā)育，而對野生型菌株Wt01-23無顯著影響。

2.2 熱激對Wt01-23和StRNAi9-10菌絲形態(tài)的影響

熱激處理后，野生型菌株Wt01-23對照組和處理組菌絲均為灰綠色、表面平滑、菌隔清晰明顯；突變體StRNAi9-10對照組和處理組菌絲均為灰褐色、表面平滑、菌隔清晰明顯(圖2)。說明熱激對Wt01-23和StRNAi9-10菌株的菌絲形態(tài)沒有產(chǎn)生顯著影響。

*表示與對照組相比P<0.05，**表示P<0.01

圖2 熱激處理后玉米大斑病菌Wt01-23和StRNAi9-10的菌絲形態(tài)

2.3 熱激對Wt01-23和StRNAi9-10分生孢子產(chǎn)量的影響

經(jīng)過熱激處理后，玉米大斑病菌Wt01-23及

StRNAi9-10的分生孢子產(chǎn)量均顯著增加，說明二者的產(chǎn)孢能力顯著增強。在25 ℃處理時，突變體StRNAi9-10的分生孢子產(chǎn)量極顯著低于野生型菌株Wt01-23；但是經(jīng)過熱激處理后，Wt01-23和StRNAi9-10的分生孢子產(chǎn)量均極顯著高于Wt01-23對照組，且熱激處理后Wt01-23和StRNAi9-10的分生孢子產(chǎn)量差異不明顯(圖3)，說明StRNAi9-10菌株的分生孢子發(fā)育能力得到了恢復(fù)，趨向于野生型Wt01-23的水平。

2.4 熱激對Wt01-23和StRNAi9-10Stste12因表達量的影響

通過半定量PCR技術(shù)檢測和Quantity One軟件對電泳圖譜進行的定量分析發(fā)現(xiàn)，在25 ℃、30 ℃、

35 ℃、40 ℃和45 ℃熱激脅迫下，野生型菌株Wt01-23中Stste12基因的電泳條帶亮度和表達量無顯著差異(圖4A和4B)。而隨處理溫度的增加，StRNAi9-10的Stste12基因條帶亮度逐漸增強(圖4A)。以25 ℃時Wt01-23菌株的Stste12表達量為對照進行比較發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的增加，StRNAi9-10的Stste12基因表達量由極顯著差異趨向于差異不顯著(圖4B)，表明隨溫度上升Stste12基因的表達量逐漸增加，45 ℃時表達量增加最多，接近野生型Wt01-23的表達水平。試驗結(jié)果表明，在熱激脅迫條件下，玉米大斑病菌StRNAi9-10的菌絲細胞內(nèi)基因表達會發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致Stste12的表達水平顯著增強，甚至接近于玉米大斑病菌野生型Wt01-23的表達水平。

**表示與Wt01-23對照組相比P<0.01

A.瓊脂糖凝膠電泳檢測； B.灰度分析。*表示與25 ℃處理的Wt01-23菌株相比P<0.05，**表示P<0.01

3 結(jié)論與討論

STE12是PMK信號途徑中一個重要的調(diào)控因子，在植物病原真菌的分生孢子形成、侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育及致病力形成等方面具有重要調(diào)控作用[7]。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的增加，玉米大斑病菌野生型菌株Wt01-23的菌落形態(tài)、生長速度和菌絲形態(tài)均未受到顯著影響，但分生孢子的數(shù)量顯著增加，這與Milus等[11]對小麥條銹病菌的試驗結(jié)果一致，說明在玉米大斑病菌中，該試驗條件的熱激處理，除了顯著促進分生孢子形成相關(guān)基因的表達外，并未對菌絲形態(tài)建成等其他基因產(chǎn)生顯著影響。突變體StRNAi9-10菌株隨著熱激溫度的升高，菌落的形態(tài)、生長速度及分生孢子產(chǎn)量均與其對照組呈現(xiàn)顯著差異，且Stste12基因的表達量較對照組顯著增加，表明熱激可以恢復(fù)Stste12基因表達。

RNAi是由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達，主要包括siRNA的形成和siRNA與沉默復(fù)合物結(jié)合2個步驟[15-16]，受到多種因子的參與和調(diào)控。本試驗中，隨著培養(yǎng)溫度的升高，玉米大斑病菌RNAi突變體StRNAi9-10的菌落形態(tài)發(fā)生了明顯的恢復(fù)；通過半定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，菌株StRNAi9-10中ste12基因的表達量隨著溫度的升高顯著提高，這與Zhong等[12]在擬南芥中的試驗結(jié)果較為相似。推測較高的溫度降低了玉米大斑病菌突變體中RNAi沉默的效率，導(dǎo)致了Stste12基因表達顯著升高，進而使Stste12基因表達量得到部分恢復(fù)，促使突變體菌株StRNAi9-10恢復(fù)野生型狀態(tài)。

目前，關(guān)于高溫脅迫研究主要集中在熱激蛋白(heat shock protein,HSP)上[17]，并明確了該蛋白的表達能夠保護細胞內(nèi)生物活性分子正常工作，顯著提高細胞在高溫脅迫下的適應(yīng)性[18-19]。Mourrain等[20]和Zhong等[12]在對擬南芥的試驗中發(fā)現(xiàn)，sgs3/sde1主要通過調(diào)控dsRNA的特異性降解起到調(diào)控沉默效應(yīng)的作用，同時發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境中sgs3基因的表達會明顯減弱，進而導(dǎo)致沉默效率顯著降低。由于在玉米大斑病菌中尚未獲得sgs/sde1類基因及其功能研究的結(jié)果，因此，下一步需找到玉米大斑病菌sgs/sde1相關(guān)基因，闡明玉米大斑病菌中高溫脅迫影響RNAi的機制。

[1] Dong J,Fan Y,Gui X,etal.Geographic distribution and genetic analysis of physiological races ofSetosphaeriaturcicain northern China[J].American Journal of Agricultural and Biological Sciences,2008,3(1):389-398.

[2] Perkins J M,Pedersen W L.Disease development and yield losses associated with leaf northern blight on corn[J]. Plant Disease,1987,71(10):940-943.

[3] Yang S H,Sharrocks A D,Whitmarsh A J.Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades[J]. Gene,2003,320(4):3-21.

[4] Krens S F,Spaink H P,Snaar-Jagalska B E.Functions of the MAPK family in vertebrate-development[J].FEBS Lett,2006,580(21):4984-4990.

[5] Chen R E,Thorner J.Function and regulation in MAPK signaling pathways:Lessons learned from the yeastSaccharomycescerevisiae[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2007,1773(8):1311-1340.

[6] Errede B,Ammerer G.STE12,a protein involved in cell-type-specific transcription and signal transduction in yeast,is part of protein-DNA complexes[J].Genes & Development,1989,3(9):1349-1361.

[7] Rispail N,Di Pietro A.The homeodomain transcription factor Ste12:Connecting fungal MAPK signalling to plant pathogenicity[J].Communicative & Integrative Biology,2010,3(4):327-332.

[8] 張運峰.碳源對Stste12基因調(diào)控玉米大斑病菌生長和分生孢子發(fā)育的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,45(1):71-75.

[9] 吳敏.玉米大斑病菌MAPK級聯(lián)途徑中Stste12基因的克隆與功能分析[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[10] Carr?r A,Brion J D,Alami M,etal.Regulation of the heat-shock response[J].Plant Physiology,1998,117(4):1135-1141.

[11] Milus E A,Kristensen K,Hovmoller M S.Evidence for increased aggressiveness in a recent widespread strain ofPucciniastriiformisf.sp.triticicausing stripe rust of wheat[J].Phytopathology,2009,99(1):89-94.

[12] Zhong S H,Liu J Z,Jin H,etal.Warm temperatures induce transgenerational epigenetic release of RNA silencing by inhibiting siRNA biogenesis inArabidopsis[J].PNAS,2013,110 (22):9171-9176.

[13] 王梅娟,李坡,吳敏,等.高滲脅迫對玉米大斑病菌生長發(fā)育及STK1表達的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(19):3965-3970.

[14] 張鑫,曹志艷,劉士偉,等.玉米大斑病菌聚酮體合成酶基因StPKS功能分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(8):1603-1609.

[15] McManus M T,Sharp P A.Gene silencing in mammals by small interfering RNAs[J].Nature Reviews Genetics,2002,3(10):737-747.

[16] Nykanen A,Haley B,Zamore P D.ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway[J].Cell,2001,107(3):309-321.

[17] Morishima N.Control of cell fate by Hsp70:More than an evanescent meeting[J].Journal of Biochemistry,2005,137(4):449-453.

[18] 陳亞瓊,肖調(diào)江,周浙昆.熱激蛋白與生物環(huán)境適應(yīng)及進化的關(guān)系[J].自然科學(xué)進展,2006,16(9):1066-1073.

[19] 曹華寧,劉博,劉太國,等.小麥條銹菌hsp70基因的克隆及熱脅迫下的表達特征分析[J].植物保護,2015,41(3):19-24.

[20] Mourrain P,Beclin C,Elmayan T,etal.ArabidopsisSGS2 andSGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance[J].Cell,2000,101(5):533-542.

Effects of Heat Shock Treatment on Development ofStste12 Silencing Mutant ofSetosphaeriaturcica

ZHANG Yunfeng

(Department of Life Science,Tangshan Normal University,Tangshan 063000,China)

In order to explore the effect of temperature rise on the growth andStste12 expression ofSetosphaeriaturcicaStste12 silencing mutants,the effects of heat shock treatment on the colony and mycelium morphology,colony growth speed,and spore formation of wild-type strain Wt01-23 andStste12 silencing mutant StRNAi9-10 were analyzed in this paper,and semi-quantitative PCR was performed to examine the effect of heat shock treatment on the expression ofStste12.The results demonstrated that heat shock treatment had no significant impact on the colony growth speed and morphology of Wt01-23，but significantly accelerated the growth of StRNAi9-10,which had similar growth speed and colony morphology to Wt01-23 under the heat shock treatment.Stste12 mRNA level in StRNAi9-10 was significantly up-regulated after heat shock treatment in a temperature-dependent manner,but not in Wt01-23.These data showed that heat shock treatment could inhibit RNAi silencing,and restore the physiological characteristics ofSetosphaeriaturcicaRNAi mutant.

heat shock;Setosphaeriaturcica; development;Stste12; semi-quantitative PCR

2016-05-15

國家自然科學(xué)基金項目(31271997)；河北省自然科學(xué)基金項目(C2014105067)；河北省留學(xué)人員科技活動項目(C2015005009)；唐山師范學(xué)院科學(xué)研究基金項目 (2014E04，2013A03)

張運峰(1982-)，男，河北石家莊人，實驗師，碩士，主要從事植物病理學(xué)與分子生理學(xué)的相關(guān)研究。 E-mail:zyfikx@126.com

S435.131;Q935

A

1004-3268(2016)11-0071-05