胡京昂，萬秀娟，李自娟，應(yīng)芳卿，黃 文(鄭州市蔬菜研究所，河南 鄭州 450015)

番茄褪綠病毒鄭州分離物外殼蛋白基因的克隆與序列分析

胡京昂，萬秀娟，李自娟，應(yīng)芳卿，黃 文
(鄭州市蔬菜研究所，河南 鄭州 450015)

近年來鄭州番茄產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似番茄褪綠病毒(ToCV)侵染引起的葉脈間褪綠癥狀，為了確定病原種類，采集典型癥狀的葉片，提取RNA，根據(jù)已知的ToCV基因組序列設(shè)計特異性引物ToCVCPF/ToCVCPR，采用RT-PCR方法對樣品進行檢測，擴增得到約750 bp大小的目的條帶，對獲得的特異性片段回收、克隆、測序后進行序列同源性及系統(tǒng)進化分析。結(jié)果顯示，鄭州病樣的病毒分離物外殼蛋白基因由774 bp組成，其核苷酸和氨基酸序列與ToCV其他分離物同源性均在96%以上；進化分析表明，鄭州分離物與河北、天津分離物親緣關(guān)系最近。造成鄭州番茄產(chǎn)區(qū)褪綠癥狀的病原為ToCV。

番茄褪綠病毒； 外殼蛋白； 基因克隆； 序列分析

番茄是一種高效益的蔬菜作物，隨著設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，良好的保護地設(shè)施為番茄提供了適宜的生態(tài)環(huán)境，但也為番茄上的各種病蟲害提供了發(fā)生和擴散的條件，造成番茄病蟲害的大面積暴發(fā)。其中，病毒病成為影響番茄產(chǎn)量與品質(zhì)的主要病害，據(jù)報道多種病毒可侵染番茄并造成危害，如番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus,ToCV)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、馬鈴薯Y病毒(potato virus Y,PVY)等[1]。世界范圍內(nèi)煙粉虱大面積發(fā)生，由其傳播的病毒病給番茄生產(chǎn)帶來了巨大的損失，危害番茄的由煙粉虱傳播的病毒主要有TYLCV、ToCV和番茄侵染性褪綠病毒(tomato infectious chlorosis virus,TICV)。自國內(nèi)報道TYLCV發(fā)生以來，番茄黃化曲葉病毒病已經(jīng)成為國內(nèi)番茄生產(chǎn)上的主要病害[2-7]。近幾年，在山東、北京、河南等地一種疑似營養(yǎng)缺失的癥狀在番茄產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)，利用ToCV和TICV特異性引物進行分子生物學檢測，結(jié)果表明，該癥狀是ToCV侵染引起的番茄褪綠病毒病導(dǎo)致[8-11]。

ToCV 1998 年首次在美國佛羅里達州被發(fā)現(xiàn)[12]，隨后意大利、巴西、以色列等地相繼報道[13-15]。ToCV屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)成員[16]。該病毒基因組為二分體正義單鏈RNA，一共包含有13個開放閱讀框，基因組全長約16.8 kb，其中RNA1長8 594 bp，RNA2長8 242 bp，分別包裹在2種粒子中。外殼蛋白(coat protein,CP)主要參與病毒的組裝、包被以及病毒運輸，外殼蛋白的缺失會導(dǎo)致病毒無法形成完整的病毒粒子[17]。在自然條件下，ToCV可以通過4 種分屬于2個屬的粉虱傳播，可以侵染茄科、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科等植物，不能通過摩擦接種和種子傳播。感染ToCV的植株，其典型癥狀類似營養(yǎng)缺失的褪綠黃化，首先在植株的下部葉片上出現(xiàn)，發(fā)病初期葉片除葉脈仍保持綠色外，脈間變黃，葉片變厚，同時伴隨部分葉片邊緣卷曲、葉片黃化、出現(xiàn)壞死斑點等癥狀，到后期造成整株死亡，果實受到嚴重影響[16]。本研究以鄭州地區(qū)表現(xiàn)突出癥狀的植株為樣品，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的ToCV基因組序列設(shè)計引物，通過RT-PCR擴增ToCVCP基因序列，并對其進行進化分析，明確鄭州分離物的分類地位，以期為該病毒病的防治和抗病毒品種的培育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒樣本 2014年8月在鄭州蔬菜研究發(fā)展中心番茄大棚中采集葉脈間褪綠、黃化的番茄葉片，編號為ZZ；并同時采集相應(yīng)大棚中健康番茄葉片作為陰性對照；實驗室保存的被ToCV感染的葉片作陽性對照。

1.1.2 生化試劑 TRIzol 購自Invitrogen公司；RTase M-MLV(RNase H-)、RNase Inhibitor購自Promega公司；凝膠回收純化試劑盒、Taq酶和DL2000 DNA Marker均購自杭州博日科技有限公司；dNTPs和T4 DNA Ligase 購自TaKaRa公司；GeneFinderTM購自廈門百維信生物科技有限公司。

1.1.3 菌株和載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株由鄭州市蔬菜生物技術(shù)重點實驗室保存；克隆載體pMD18-T 購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA提取 采用TRIzol提取法。取番茄葉片樣本約0.1 g,在液氮中研磨后迅速轉(zhuǎn)移到1.5 mL DEPC處理的離心管中，加入1 mL TRIzol試劑，振蕩均勻放置室溫5 min后，12 000 r/min離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的DEPC處理的1.5 mL離心管中，加入0.2 mL氯仿混勻，室溫放置10 min后再次12 000 r/min離心15 min；仍將上清液轉(zhuǎn)移到DEPC處理的離心管中，加入0.5 mL異丙醇混勻，置于-20 ℃靜置30 min，12 000 r/min離心10 min后，用75%乙醇洗滌沉淀；最后用無核酸酶的去離子水溶解，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR擴增、克隆和測序 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的ToCV基因組序列，設(shè)計特異性引物ToCVCPF(5′-ATGGAGAACAGTGCTGTTGCAA-3′)和ToCVCPR(5′-TTAGCAACCAGTTATCGATGCA-3′)，對獲得的植物總RNA進行RT-PCR擴增。

在DEPC處理的離心管中加入總RNA 5.0 μL、10 μmol/L ToCVCPR引物1.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，用無核酸酶的超純水補充總體積至10 μL，70 ℃變性10 min，立即冰上放置2 min。再加入5×M-MLV Buffer 5.0 μL、200 U/μL RTase M-MLV(RNase H-)1.0 μL、40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，用無核酸酶的超純水補充總體積至25 μL，37 ℃水浴60 min。

以獲得的cDNA第一鏈為模板，擴增ToCVCP基因序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下：cDNA 5.0 μL、5 U/μLTaqDNA Polymerase 1.0 μL、10 μmol/L ToCVCPF和ToCVCPR引物各1.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL,ddH2O補充至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，加入Loading buffer和GeneFinder后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，在可見光透視儀上顯示電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，將其克隆到pMD18-T載體上，陽性克隆經(jīng)驗證后送北京三博遠志生物技術(shù)有限公司測序，將測序的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫收錄，登錄號為KR150986。

1.2.3 序列比對分析 利用NCBI序列比對工具BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析測得的序列，根據(jù)相似性確定病毒種類，并與國際上報道的ToCVCP序列進行相似性分析。已報道的ToCV分離物為美國分離物(ToCV-USA，登錄號：AY903448)、日本分離物(ToCV-Japan，登錄號：AB513443)、韓國分離物(ToCV-HS，登錄號：KP137099)、西班牙分離物(ToCV-Spain，登錄號：DQ136146)、希臘分離物(ToCV-Greece，登錄號：HG380088)、法國分離物(ToCV-France,登錄號：EU625350)、中國山東分離物(ToCV-SDSG，登錄號：KC709510)、南京分離物(ToCV-Nanjing，登錄號：KJ815045)、北京分離物(ToCV-BJ，登錄號：KC887999)、天津分離物(ToCV-TJ6，登錄號：KP219722)、河北分離物(ToCV-HBSJZ，登錄號：KP217200)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄田間病害癥狀

番茄植株感病后主要癥狀為植株中下部葉片黃化，葉脈濃綠而脈間褪綠，與缺素癥狀相似(圖1)。

2.2 番茄樣品RT-PCR擴增結(jié)果

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用ToCVCPF/ToCVCPR特異性引物對番茄樣品進行PCR擴增，ZZ樣品中擴增出750 bp左右的特異性條帶，與ToCV侵染的番茄樣品(陽性對照)中擴增的條帶大小一致(圖2)，表明待檢測樣品可能感染ToCV。

2.3 ToCV鄭州分離物序列分析

將ZZ樣品中PCR擴增的特異性片段純化、克隆、測序，結(jié)果表明，ToCV鄭州分離物CP基因序列由774 bp組成。將獲得的CP基因序列用DNAMAN Version 4.0進行處理和分析，結(jié)果見表1，該分離物CP基因核苷酸序列與法國分離物和西班牙分離物的同源性分別為97.7%和97.2%，與其他ToCV分離物同源性均在99%以上。ToCV鄭州分離物CP基因氨基酸序列比對表明：鄭州分離物與日本、天津和美國分離物的同源性均在99%以上，而與其他地區(qū)分離物的同源性在96.9%～98.8%。

圖1 感染ToCV葉片癥狀

M：DL2000 DNA Marker； 1：陰性對照； 2：ZZ樣品； 3：陽性對照圖2 番茄樣品PCR檢測結(jié)果

表1 不同地區(qū)ToCV分離物CP基因核苷酸(左下方)和氨基酸(右上方)序列同源性比較 %

采用Mega 4.0的臨近相鄰法(Neighbor-Joining)將該分離物CP基因核苷酸序列與其他11個具有代表性的ToCV分離物序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)，結(jié)果顯示：鄭州分離物與希臘分離物、西班牙分離物及法國分離物分別在3個不同的大分支；來源于國內(nèi)的南京、北京、山東、河北、天津、鄭州分離物和韓國、美國、日本分離物聚在一個小分支，其系統(tǒng)進化關(guān)系較近；鄭州分離物與河北、天津分離物系統(tǒng)進化關(guān)系較其他國內(nèi)分離物近。

圖3 不同地區(qū)ToCV分離物CP基因核苷酸序列系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論與討論

番茄褪綠病毒病是繼番茄黃化曲葉病毒病后又一種危害嚴重的番茄病毒病，可由2個屬的粉虱傳播，由于傳播介體種類多，加大了該病害的發(fā)生與擴散程度，粉虱的防控難度較大，因而該病害的及時發(fā)現(xiàn)與鑒定尤為重要。本研究利用分子生物學技術(shù)，對鄭州地區(qū)表現(xiàn)褪綠癥狀的番茄樣品中ToCVCP基因進行克隆和分析發(fā)現(xiàn)，ToCV鄭州分離物CP基因序列由774 bp組成，該基因核苷酸序列及氨基酸序列與ToCV其他分離物的同源性均在96%以上，系統(tǒng)進化樹分析表明，來源于國內(nèi)的南京、北京、山東、河北、天津、鄭州分離物和韓國、美國、日本分離物聚在一個小分支，其系統(tǒng)進化關(guān)系較近，其中鄭州分離物與河北、天津分離物的系統(tǒng)進化關(guān)系較其他國內(nèi)分離物近。我國的ToCV來源于韓國、日本及美國的可能性較大，可能與國際交往中番茄及煙粉虱活體帶毒傳播相關(guān)。鄭州地區(qū)與河北、天津距離較近，其ToCV分離物親緣關(guān)系密切，可能與種苗調(diào)運、煙粉虱的擴散有關(guān)。

由于番茄黃化曲葉病毒病在國內(nèi)普遍發(fā)生，近幾年，通過物理、化學防控傳播介體和抗TYLCV番茄品種推廣等措施的應(yīng)用，該病害得到一定程度的控制?？筎YLCV番茄品種的種植，降低了該病害在生產(chǎn)中的危害，然而在種植過程中農(nóng)戶忽視對煙粉虱的防控，造成煙粉虱蟲口密度過大，煙粉虱是TYLCV和ToCV的共同傳播介體，在本研究采集樣品的大棚里，大量的煙粉虱聚集在番茄葉片上，因此，鄭州地區(qū)番茄褪綠病毒病的流行可能是煙粉虱傳播導(dǎo)致。番茄褪綠病毒病在國內(nèi)的山東、北京、河北、河南、天津等地均有發(fā)生，其癥狀易與缺素癥狀混淆，在生產(chǎn)中會造成誤判，延誤防控時機，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大危害和損失，因此對該病毒病的檢測、鑒定和防控是當務(wù)之急，確立規(guī)范的病毒基因檢測體系和便捷快速的檢測方法顯得尤為重要。利用分子檢測手段比傳統(tǒng)的人工接種方法更迅速、便捷和準確，本研究利用設(shè)計的CP基因特異性引物，通過RT-PCR方法可以檢測ToCV，為該病害的快速、準確檢測和鑒定提供了技術(shù)支持。

國內(nèi)對番茄褪綠病毒病的研究主要集中在病原的檢測與病害的鑒定方法上，生產(chǎn)上缺乏抗該病的番茄品種，對番茄種質(zhì)的抗病性評價只能通過煙粉虱接種，限制了抗原的篩選速率，因此，構(gòu)建高效的ToCV侵染性克隆載體，建立快速的抗病性評價方法，培育抗ToCV的番茄品種是生產(chǎn)上亟待解決的問題。此外，本研究僅對鄭州分離物的CP基因進行了檢測和序列分析，需要進一步對各地ToCV分離物進行鑒定與分析，明確該病害的發(fā)生區(qū)域，并加強該病毒在不同地區(qū)變異及防治技術(shù)等方面的研究。

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Cloning and Sequence Analysis of Coat Protein Gene of Tomato Chlorosis Virus Isolate from Zhengzhou

HU Jing’ang，WAN Xiujuan，LI Zijuan，YING Fangqing,HUANG Wen
(Zhengzhou Vegetable Research Institute，Zhengzhou 450015,China)

The disease which showed intervinal chlorosis in tomato,the typical symptom of tomato chlorosis virus(ToCV),occurred seriously in Zhengzhou during the past several years.A pair of specific primers ToCVCPF/ToCVCPR was designed according to known genome sequences of ToCV.The disease samples were collected,and a reverse transcription(RT)-PCR assay was used to detect the virus with total RNA isolated from the disease samples using the primers ToCVCPF/ToCVCPR.The generated specific segment was collected,cloned and sequenced,and then homology comparison and molecular evolution analysis were conducted.The result indicated that a band of about 750 bp was amplified by RT-PCR,and the coat protein gene was determined to be 774 bp.The homology of the isolate from Zhengzhou was 96% or more with the other ToCV isolates at nucleotide and amino acid level.The phylogenetic analysis showed that the Zhengzhou isolate was closely related to Hebei and Tianjin isolates of ToCV.According to the classification criteria ofCrinivirus,the Zhengzhou isolate should belong to an isolate of ToCV,which caused tomato intervinal chlorosis in Zhengzhou.

tomato chlorosis virus; coat protein; gene cloning; sequence analysis

2016-03-11

河南省科技攻關(guān)計劃項目(162102110069)；河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(S2010-03-G02)

胡京昂(1979-)，男，河南滑縣人，助理研究員，博士，主要從事番茄遺傳育種研究。E-mail:hujingang05@126.com

S436.412.1

A

1004-3268(2016)09-0084-05