崔垚鑫，劉俊華，周憶蓮，劉燕霏，楊建德

銅綠假單胞菌遺傳演化分析

崔垚鑫，劉俊華，周憶蓮，劉燕霏，楊建德通信作者

（天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

為研究銅綠假單胞菌（Pa）的遺傳演化規(guī)律，對2018年本實驗室分離出兩株銅綠假單胞菌，經基因測序得到16s rRNA基因序列，利用NCBI中的BLAST對比搜索與分離菌株具有相近基因序列的假單胞菌株，采用lasergene 中Megalign軟件構建基因進化樹并比較分析。結果表明：Pa菌株在基因進化樹上聚為一支，說明Pa進化較穩(wěn)定，分離出的兩株Pa與來自日本的Pa（登錄號為NR_113599）關系最為親近，他們聚在一個次級分支上；分離菌株與來自美國的兩株Pa（登錄號為NR_117678與NR_114471）關系較親近，而與來自德國的Pa（登錄號為NR_026078）關系則較遠。

銅綠假單胞菌；遺傳演化；基因樹；親緣關系

銅綠假單胞菌，又稱綠膿桿菌，為革蘭陰性桿菌，該菌在1882年首先由Gersard氏從傷口膿液中分離到[1]。銅綠假單胞菌在環(huán)境中普遍存在，常見于正常人與動物腸道、皮膚上，也可在外傷、燒傷及尿道感染等處發(fā)現(xiàn)。銅綠假單胞菌可感染多種動物，造成不同程度的經濟損失，常見的疾病如雛雞的急性敗血死亡、貂的出血性肺炎、羊的化膿性肺炎、竹鼠的急性死亡等[2-6]。近些年來，因為銅綠假單胞菌感染人與動物的報道與日俱增，逐漸引起了人們的注意。

16S rRNA基因長度約為1 542 bp，序列長度適中，其結構中既有保守區(qū)又有變化區(qū)域，是較良好的生物標識[7-8]?；驕y序技術快速發(fā)展，特別是高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）的出現(xiàn)，在微生物鑒別方面起到了一定的作用[9-10]。本試驗對從本實驗室分離出的兩株銅綠假單胞菌的16S rRNA進行同源序列比較并構建基因進化樹，探究其進化規(guī)律，對大范圍內防治此類細菌感染提供參考依據(jù)。

1 材料

本實驗室分離出的兩株Pa[11]。

2 方法

2.1 基因的測序與篩選

對本實驗室分離菌株Pa-zhu和Pa-zr進行16S rRNA測序，其Genbank登錄號分別為MK713645和MK713646。利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST比對，將Pa的基因序列輸入到搜索框內，用在線BLAST工具進行比對，篩選基因一致性達到95%以上的多種假單胞菌。對這些序列進行下載，查看序列信息并記錄。

2.2 基因進化樹的構建

利用lasergene 中Megalign軟件構建基因進化樹并進行同源性比較分析。

3 結果與分析

3.1 基因的篩選

在NCBI中使用BLAST對比工具，將分離菌株的16S rRNA序列輸入搜索框內，可得到100個相似的基因序列，從中挑選21個來源明確、長度合適、同源性又達到95%以上的假單胞菌的 16S rRNA進行下載，見表1。

表1 假單胞菌16S rRNA 基因序列信息

菌株名稱 國家 來源 登錄號 序列長度/bp DSM 50071 Germany（德國） NCBI NR_026078.1 1 537 DSM 50071 USA（美國） NCBI NR_117678.1 1 527 ATCC 10145 USA（美國） NCBI NR_114471.1 1 489 NBRC 12689 Japan（日本） NCBI NR_113599.1 1 461 MCC10330 USA（美國） NCBI NR_043289.1 1 531 RA26 France（法國） NCBI NR_114957.1 1 379 ATCC 14235 USA（美國） NCBI NR_112062.1 1 507 ATCC 14909 USA（美國） NCBI NR_114472.1 1 459 NBRC 14159 Japan（日本） NCBI NR_113646.1 1 462 MI 33175 Korea（韓國） NCBI NR_117827.1 1 442 IPL-1 India（印度） NCBI NR_115922.1 1 438 Stanier 63 USA（美國） NCBI NR_037000.1 1 492 NBRC14167 Japan（日本） NCBI NR_113653.1 1 462 NBRC13583 Japan（日本） NCBI NR_113617.1 1 462 ATCC 8062 USA（美國） NCBI NR_114478.1 1 440 ATCC 25411 USA（美國） NCBI NR_114477.1 1 457 ATCC 17588 USA（美國） NCBI NR_041715.1 1 458 NBRC 14165 Japan（日本） NCBI NR_113652.1 1 462 ATCC 17588 China（中國） NCBI NR_103934.2 1 537 VKM B-075 Russia（俄羅斯） NCBI NR_116489.1 1 495 CCUG 11256 Spain（西班牙） NCBI NR_118798.1 1 456

3.2 基因序列同源性分析

采用lasergene 中Megalign軟件分析基因同源性可以看出，分離出的Pa-zhu與來自日本的Pa（登錄號為NR_113599）和來自美國的兩株Pa（登錄號為NR_114471.1與NR_117678.1）的同源性達到99%以上；與來自法國的Pa（登錄號為NR_114957.1）的同源性則達到了98%以上，與其他菌株的基因序列相距較遠。分離出的另一菌株Pa-zr與來自美國的兩株Pa（登錄號為NR_114471.1與NR_117678.1）的同源性達到99%以上；與來自日本的Pa（登錄號為NR_113599.1）和來自美國的Pa（登錄號為NR_043289.1）的同源性達到了98%以上，與其他菌株親緣性較遠，見圖1。

圖1 基因同源性關系分析

3.3 基因序列進化樹的構建

將表1中的序列利用lasergene 中Megalign軟件構建基因進化樹并比較分析，見圖2?？梢钥闯?，Pa菌株在基因進化樹上聚為一支，說明Pa進化較穩(wěn)定，分離出的兩株Pa（登錄號為MK713645和MK713646）與來自日本的Pa（登錄號為NR_113599）的關系最為親近，他們聚在一個次級分支上，且同源關系在98.4 %～99.2 %之間，推測在中國分離出的兩株Pa與來自日本的Pa（登錄號為NR_113599）是由共同的祖先在亞洲的不同國家間形成了交叉進化；分離菌株與來自美國的兩株Pa（登錄號為NR_117678與NR_114471）的關系較親近，同源關系在99.0 %～99.4 %之間；而與來自的德國的Pa（登錄號為NR_026078）關系則較遠，同源關系在95.8 %～96.1 %之間。從本國分離出來的兩株Pa在進化樹上與其他假單胞菌的關系較遠。

圖2 銅綠假單胞菌遺傳進化樹分析

4 討論

銅綠假單胞菌為人類醫(yī)學中的常見菌類，但在近些年，Pa給養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的損失，銅綠假單胞菌可引起犢牛便血、雛雞內臟出血和羊劇烈腹瀉，最終導致動物死亡[12]。通過研究分離出的銅綠假單胞菌與其他假單胞菌的遺傳演化關系，可以為預防和治療銅綠假單胞菌造成的疾病提供一定的理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，所有的銅綠假單胞菌全部匯聚在一個分支上，說明銅綠假單胞菌在基因進化中相對穩(wěn)定，且銅綠假單胞菌的進化節(jié)點較靠前，說明銅綠假單胞菌在假單胞菌中屬于較古老的品種。從我國分離出的菌株（登錄號為MK713645和MK713646）與日本的銅綠假單胞菌（登錄號為NR_113599）和美國的兩株銅綠假單胞菌（登錄號為NR_117678與NR_114471）源自同一祖先，這可能與這幾個國家經貿或旅游往來密切有關，了解發(fā)達國家銅綠假單胞菌的研究可為我們防治此類感染提供重要的參考依據(jù)。銅綠假單胞菌與屬內其他假單胞菌也存在一定的親緣關系，但遺傳關系相對較遠。施氏假單胞菌（與產堿假單胞菌（）在基因進化樹上分別各聚一支，二者在基因進化樹上的支點相對靠后，說明兩種菌株雖然品種較新，但在進化過程中也趨向穩(wěn)定。而食油假單胞菌（與類產堿假單胞菌（）在基因樹上聚為一支，說明兩株菌株在進化趨勢上相對穩(wěn)定，兩者是由同一祖先進化而來的[13-14]。

[1] 蔣增海，鄧同煒，徐耀輝，等. 豬源綠膿桿菌的分離鑒定及16S rRNA基因同源性分析[J]. 河南農業(yè)科學，2017，46（4）：118-120.

[2] 閆新武，雷連成，張明亮，等. 貂源綠膿桿菌的分離鑒定及生物學特性[J]. 中國獸醫(yī)學報，2014，34（10）：1610-1614.

[3] 彭大新，張如寬，徐圻，等. 山羊綠膿桿菌感染的診 斷[J]. 中國獸醫(yī)科技，1997，27（2）：37-38.

[4] 唐珂心，牛鐘相，何元龍. 山羊慢性化膿性肺炎病原菌的分離鑒定[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2001，37（6）：20-21.

[5] 靳雙星，陳理盾，段繼永. 雛雞綠膿桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（7）：230-232.

[6] 馮世文，李軍，廖黎黎，等. 竹鼠綠膿桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（12）：182.

[7] Dewhirst F E，Paster B J，Olsen L，et al. Phylogeny of 54 representative strains of species in the family pasteurellaceae as determined by comparison of 16S rRNA sequences[J]. J Bacteriol，1992，174（6）：2002-2013.

[8] 劉馳，李家寶，芮俊鵬，等. 16S rRNA基因在微生物生態(tài)學中的應用[J]. 生態(tài)學報，2015（9）：2769.

[9] Tucker T，Marra M，F(xiàn)riedman J M. Massively parallel sequencing：he next big thing in genetic medicine[J]. Am J Hum Genet，2009，85（2）：142-154.

[10] Anderson M W，Schrijver I. Next generation DNA sequencing and the future of genomic medicine[J]. Genes （Basel），2010，1（1）：38-69.

[11] 竹堃園，劉燕霏，楊建德，等. 犬子宮蓄膿中綠膿桿菌分離鑒定及耐藥性分析[J]. 天津農學院學報，2018，25（3）：47-51.

[12] 王文貴，胡景韶，張道永. 動物感染綠膿桿菌的調 查[J]. 中國獸醫(yī)科技，1991（7）：17-18.

[13] Hamidou Soumana I，Linz B，Harvill E T. Environmental origin of the genus bordetella[J]. Front Microbiol，2017，8：28.

[14] 陸春萌，李明義，劉新文，等. 豬胸膜肺炎放線桿菌ZY株TfbA基因的克隆及序列分析[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2007，39（2）：11-13.

Genetic Evolution Analysis of

CUI Yao-xin, LIU Jun-hua, ZHOU Yi-lian, LIU Yan-fei, YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to study the genetic evolution of（Pa）, two strains of Pa were isolated in our laboratory in 2018. The 16s rRNA gene sequence was obtained by gene sequencing. The BLAST in NCBI was used to search forstrains with similar gene sequence to the isolated strains, and Megalign software in lasergene was used to construct the gene evolutionary tree and make comparative analysis. The results showed that Pa strains clustered into one branch on the gene evolution tree, indicating that Pa evolution was relatively stable. The two isolated Pa strains had the closest relationship with Pa from Japan（login number is NR_113599）, and they clustered on a secondary branch. The relationship between the isolated strain and Pa（Genbank login numbers NR_117678 and NR_114471）from the United States is relatively close. However, the relationship with Pa from Germany（login number is NR_026078）was far away.

; genetic evolution; gene tree; genetic relationship

1008-5394（2020）02-0052-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.012

S852.61

A

2019-05-13

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（201810061047）；天津市自然科學基金項目（07JCYBJC16000）

崔垚鑫（1997-）男，本科在讀，研究方向：預防獸醫(yī)學。E-mail：1977008536@qq.com。

楊建德（1969-）男，教授，博士，主要從事預防獸醫(yī)學方面的教學與研究。E-mail：jiandeyang@126.com。

責任編輯：張愛婷