魏晶晶，李聰研，孫亞波，李秋菊，宋瀟婷，劉富東，史文艷，寧宜寶，孫曄,，沈青春,*

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3.吉林和元生物工程股份有限公司，吉林松原138000)

豬肺炎支原體S株的分離與鑒定

魏晶晶1，李聰研1，孫亞波1，李秋菊3，宋瀟婷1，劉富東1，史文艷1，寧宜寶2，孫曄1,2，沈青春1,2*

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3.吉林和元生物工程股份有限公司，吉林松原138000)

從典型豬肺炎支原體病變肺組織傳代分離到一株支原體，經(jīng)培養(yǎng)特性、血清學(xué)鑒定、生化鑒定、PCR檢測及測序分析證明其為豬肺炎支原體，純化后命名為S株。將S株P(guān)46基因和P97基因R1區(qū)的氨基酸序列與其他菌種的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，該菌株P(guān)46基因氨基酸序列與其他菌種同源高達(dá)99%以上，P97基因R1區(qū)的氨基酸重復(fù)數(shù)為11個(gè)，不同于其他菌株；免疫原性試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株具有良好的免疫原性。

豬肺炎支原體；分離；檢測；鑒定

豬支原體肺炎，又稱豬地方流行性肺炎(EPS)，俗稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體引起的一種慢性、消耗性呼吸道傳染病。主要的臨床特征表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、生長遲緩，一般不引起豬的死亡，但有時(shí)感染率可達(dá)90%以上，容易與其他疾病(如藍(lán)耳病、傳染性胸膜肺炎、豬瘟等)協(xié)同感染，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。該病分布十分廣泛，世界各地均有發(fā)生，也被認(rèn)為是危害各國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[1]。由于豬肺炎支原體的生長繁殖對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的要求極其苛刻，而其田間分離時(shí)其常和細(xì)菌性疾病混合感染(如豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌[2-3]、副豬嗜血桿菌[3-4]、豬鼻支原體[5-7]等)，導(dǎo)致分離到純凈的豬肺炎支原體相當(dāng)困難。本研究通過從吉林的發(fā)病豬場采集病變肺組織，進(jìn)行分離，培養(yǎng)，并對其進(jìn)行培養(yǎng)特性、生化鑒定、血清學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,并對其特征性基因序列與國內(nèi)外所發(fā)表的序列進(jìn)行比對[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 病料與菌毒種來源 10份具有典型豬支原體肺炎病變特征的豬肺組織，來自吉林的2家商品代豬場。豬肺炎支原體強(qiáng)毒JN株、豬肺炎支原體232株和豬鼻支原體BST-7，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 PPLO與豬血清購自GIBCO公司；PCR相關(guān)試劑購自全式金公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；兔抗Mhp特異性陽性血清(瓊擴(kuò)效價(jià)1∶16)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。LPS液體培養(yǎng)基(含PPLO、葡萄糖、MEM等)和豬肺炎支原體間接血凝(IHA)抗原(批號：201305)由北京中海生物科技有限公司自制。IMS 1313水性佐劑，法國賽比克公司提供。進(jìn)口豬支原體肺炎復(fù)合佐劑滅活疫苗，批號為BH14011，市場購買。

1.1.3 試驗(yàn)動物 清潔級健康家兔，來自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。7～14日齡健康仔豬，購自吉林松原市商品代豬場，母豬免疫豬支原體肺炎疫苗，仔豬豬肺炎支原體抗原、抗體陰性，豬瘟、豬偽狂犬與豬藍(lán)耳病抗原陰性。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 將無菌采集病變肺組織置于一次性平皿中，撕去筋膜，經(jīng)含一定濃度青霉素的PBS反復(fù)清洗后，剪碎后用高速勻漿機(jī)處理，取1.0 mL勻漿液接種于含19.0 mL LPS液體培養(yǎng)基的鹽水瓶中，(37±1) ℃培養(yǎng)10～14 d，每天觀察記錄培養(yǎng)基顏色變化情況。對待分離病料勻漿液使用豬肺炎支原體16s RNA特異性引物進(jìn)行PCR檢測。

7 d以內(nèi)培養(yǎng)基顏色明顯變化的小管進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，結(jié)果為陰性的樣品放棄分離；14 d內(nèi)出現(xiàn)顏色變化的小管經(jīng)PCR檢測結(jié)果為陽性的，立即傳代培養(yǎng)；14 d后如仍未變色則對其進(jìn)行忙傳，同時(shí)進(jìn)行PCR檢測。

1.2.2 菌落形態(tài)和生化鑒定 對分離物使用LPS培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待其生長時(shí)間和活菌滴度穩(wěn)定后進(jìn)行菌落形態(tài)和生化鑒定。

菌落形態(tài)：將新鮮培養(yǎng)物稀釋100倍后，接種LPS固體培養(yǎng)基，置5% CO2的培養(yǎng)箱中，(37±1)℃培養(yǎng)7 ～14 d，7 d后開始每日使用低倍顯微鏡觀察支原體菌落一次。

生化鑒定：取單菌落純化后的培養(yǎng)物，分別接種含0.5%葡萄糖、尿素、精氨酸的液體培養(yǎng)基中，(37±1)℃培養(yǎng)7 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化情況以確定培養(yǎng)物對其是否發(fā)酵。

1.2.3 血清學(xué)鑒定 代謝抑制試驗(yàn)：使用液體培養(yǎng)基對分離株進(jìn)行10倍比稀釋至10-7，在10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度分別取1 mL，加入到裝有1 mL含20%兔抗Mhp陽性血清的液體培養(yǎng)基的小管中混勻，取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度各2 mL作為對照組。另設(shè)2 mL液體培養(yǎng)基作空白對照組，于(37±1)℃培養(yǎng)14 d后判定結(jié)果?？瞻讓φ詹蛔兩瑢φ战M3個(gè)滴度都變黃，試驗(yàn)組至少10-6、10-7兩個(gè)滴度不變色即可判定為分離物只含有豬肺炎支原體。

生長抑制試驗(yàn):將直徑6 mm濾紙片用兔抗Mhp陽性血清浸濕后干燥待用。將培養(yǎng)物稀釋成含104CFU/mL，取0.5 mL涂布于LPS固體培養(yǎng)基表面，取2片含兔抗Mhp陽性血清的濾紙片，均勻貼于瓊脂表面，設(shè)豬肺炎支原體232株培養(yǎng)物作為對照。(37±1)℃培養(yǎng)14 d，在低倍鏡下觀察，當(dāng)濾紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈大于1.0 mm者表示該菌種與抗血清系免疫原同種。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1 PCR鑒定 采用豬肺炎支原體的16 s RNA特異性引物[10]進(jìn)行篩查和鑒別檢驗(yàn)，其擴(kuò)增條帶大小分別為649 bp，反應(yīng)條件：預(yù)變性后94 ℃/30 s、56 ℃/30 s、72 ℃/45 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。使用可同時(shí)鑒別豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬絮狀支原體多重PCR引物[11]檢驗(yàn)，其擴(kuò)增片段大小依次分別為1000 bp、1129 bp和754 bp，反應(yīng)條件：預(yù)變性后94 ℃/30 s、54 ℃/30 s、72 ℃/60 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。多重PCR可以確定培養(yǎng)物為豬肺炎支原體，而且可以判定是否有其他兩種豬源支原體的污染。

1.2.4.2 特異性基因的克隆 P46、P97蛋白基因是豬肺炎支原體的具有較強(qiáng)種特異性的基因，根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)[8, 10, 12]和NCBI上公布的豬肺炎支原體232株的P46、P97基因全序列各設(shè)計(jì)一對特異性引物。P46基因引物為P46-F：5'-CGGGATCCACTTCAGATTCTAAACCACAA-3'，P46-R：5'-CCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTATCAAC-3'，目標(biāo)片段大小為1105 bp；P97蛋白R1區(qū)擴(kuò)增引物為P97-F：5'-GGTATATTGCCTCAGCCC-3', P97-R：5'-GTGAAAAGCCAGTATTAGTA-3，R1區(qū)是一個(gè)高變重復(fù)區(qū)，不同菌種的重復(fù)數(shù)量不同，因此擴(kuò)增片段大小會有較大的差別，Mhp 232株的擴(kuò)增片段大小預(yù)計(jì)為為344 bp。DNA模板采用熱裂解法制備[13]，根據(jù)兩對引物各自的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。1.2.4.3 序列分析 對分離株的P46和P97 R1區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行雙向測序，并同GENEBANK和現(xiàn)有的其他菌種進(jìn)行序列同源性分析和比對，并依此對其進(jìn)行了分子進(jìn)化上的親緣關(guān)系分析。

1.2.5 免疫原性測定 將豬肺炎支原體S株使用LPS培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)大后，收獲、滅活菌液，再將其與法國賽比克公司IMS 1313水佐劑按(V/V)1:1的比例混合，攪拌均勻后制備水劑滅活疫苗。

對家兔的免疫原性:1.2～1.5 kg健康家兔15只，5只為空白對照，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組各5只，各組分別前腿部肌肉注射試驗(yàn)苗和進(jìn)口滅活疫苗0.2 mL，14 d后后腿肌肉注射0.2 mL。首免后21 d檢測各組家兔的豬肺炎支原體IHA抗體效價(jià)。

本動物免疫攻毒試驗(yàn):用7～14日齡健康易感仔豬15頭，其中5頭對照，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組各5頭，分別用于S株試驗(yàn)苗和進(jìn)口滅活疫苗的免疫，每頭左頸部肌肉注射1.0 mL，14 d后右側(cè)頸部肌肉注射1.0 mL。首免后30 d，連同對照組使用豬肺炎支原體JN株肺組織毒進(jìn)行氣管內(nèi)攻毒，5 mL/頭(含肺組織量0.1 g)。觀察28 d后剖檢，豬支原體肺炎病變指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)5.5分法進(jìn)行評分和計(jì)算[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果 10份分離樣品中的7份在培養(yǎng)3～5 d即發(fā)生顯著的顏色變化，經(jīng)無菌和支原體檢驗(yàn)結(jié)果表明其中2個(gè)樣品有細(xì)菌污染，5個(gè)樣品污染了疑似豬鼻支原體。3份到14 d仍未變色，其中2份樣品傳代后經(jīng)豬肺炎支原體特異性PCR檢測結(jié)果為陰性。1份樣品的分離物在傳代后13 d發(fā)生了明顯的顏色變化，經(jīng)檢測PCR檢測分離物中含豬肺炎支原體。

將分離菌株連續(xù)傳遞至第5代后，10%接種量生長時(shí)間在3 d左右，活菌數(shù)CCU穩(wěn)定在109CCU/mL。

2.2 菌落形態(tài)和生化鑒定 分離物在LPS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，針尖大小的菌落，顯微鏡下觀察為表面略有顆粒狀，大多數(shù)菌落邊緣不整齊的菌落，挑取形態(tài)較為典型的中等大小菌落進(jìn)行克隆純化，純化后的菌株命名為豬肺炎支原體S株。

生化鑒定結(jié)果為培養(yǎng)物能發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵尿素和精氨酸，符合豬肺炎支原體的代謝特性。

2.3 血清學(xué)鑒定 代謝抑制試驗(yàn)：各試驗(yàn)小管于37 ℃培養(yǎng)14 d后，空白對照不變色，陰性對照組3個(gè)滴度10-5、10-6、10-7都變黃，試驗(yàn)組相應(yīng)的三個(gè)滴度均未變色，表明培養(yǎng)物可被兔抗Mhp高免血清完全抑制，由此表明待檢分離物為豬肺炎支原體。

生長抑制試驗(yàn)將分離株接種LPS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d后，肉眼可見針尖大小的菌落，顯微鏡下觀察為露滴狀圓形菌落，表面略有顆粒狀，但在含Mhp特異性血清濾紙片周圍1.0 mm內(nèi)無支原體菌落出現(xiàn)，結(jié)果表明待檢分離物為豬肺炎支原體。

2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果 通過16s RNA特異性引物對分離菌種、豬肺炎支原體232株和豬鼻支原體BTS-7進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1。使用多重PCR對分離菌株的F10、F15和F20代培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2。

M.DL2000 marker; 1. Mhp 232(陽性對照)；2. Mhr BTS-7(陰性對照)；3. S株圖1 使用豬肺炎支原體特異性引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M.DL2000 marker; 1. Mhp 232；2. Mhr BTS-7；3. Mfc SJ株；4.空白對照；5-7.分離株的F10、F15和F20培養(yǎng)物。圖2 使用多重PCR對培養(yǎng)物的鑒定電泳圖結(jié)果

從圖1可以看出，分離物經(jīng)16 s RNA特異性引物檢測可以擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小的特異性條帶，表明培養(yǎng)物中含有豬肺炎支原體。圖2采用豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬絮狀支原體多重PCR檢測，結(jié)果顯示分離株的F10、F15和F20代培養(yǎng)物均只能擴(kuò)增出1000 bp大小的特異條帶，表明分離物中含有豬肺炎支原體，不含豬鼻支原體和豬絮狀支原體。

2.5 P46基因和P97基因R1區(qū)檢測 使用P46基因引物和P97基因R1區(qū)引物對豬肺炎支原體S株的擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

1. DL2000 DNA Marker；2. S株 ；3. Mhp 232株(陽性對照)；4.Mhr BTS-7株(陰性對照)；圖3 對豬肺炎支原體S株的P46基因(圖A)和P97基因的R1區(qū)(圖B)的擴(kuò)增結(jié)果

上圖結(jié)果顯示，P46基因擴(kuò)增出1100 bp的條帶，與對照完全一致。P97基因R1區(qū)引物對S株的擴(kuò)增條帶大小270 bp左右，與232株的344 bp差異顯著，初步推斷為S株的R1區(qū)的重復(fù)數(shù)量比232株的數(shù)量要少，可通過序列分析進(jìn)行確認(rèn)。

2.6 測序結(jié)果分析比對 將圖2的PCR產(chǎn)物連接T載體后進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明目標(biāo)序列與豬肺炎支原體完全符合，進(jìn)一步確認(rèn)了分離物為豬肺炎支原體。使用DNA Star基因序列分析軟件對纖毛粘附蛋白P97基因-R1區(qū)擴(kuò)增的豬肺炎支原體S株與GENEBANK及國內(nèi)文獻(xiàn)上的其他菌種進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果如圖4。

圖4 P97基因R1區(qū)氨基酸序列比對結(jié)果

P97基因-R1區(qū)是豬肺炎支原體特有的氨基酸水平上的重復(fù)序列區(qū)，也同時(shí)是一個(gè)高變區(qū)。AA(V/T)PKE(V)重復(fù)序列數(shù)目因菌株的不同而不同，其中232株的重復(fù)數(shù)為15個(gè)，新分離S株的為11個(gè)，這正好解釋了圖3B中其P97 R1區(qū)擴(kuò)增片段大小不一致的原因。將R1區(qū)的序列作為依據(jù)，劃出各菌株的進(jìn)化樹和同源性關(guān)系圖，如圖5所示。

圖5 依照不同菌種的P97基因R1區(qū)氨基酸序列分析得出的進(jìn)化樹(A)和同源性比對表(B)

從進(jìn)化樹和同源性關(guān)系表可知，S株與F7.2株的情緣關(guān)系較近，與來自江蘇農(nóng)科院的168株和168L株的同源性也最高，而且AA(V/T)PKE/V重復(fù)數(shù)均為11個(gè)，但在第2、5、10、25、32、45、50位氨基酸上不同。

豬肺炎支原體S株的P46基因擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體后，進(jìn)行序列分析，并將其翻譯成氨基酸序列后，使用Lasergene 7.0軟件對其相應(yīng)序列與GENEBANK及國內(nèi)文獻(xiàn)上的其他菌種進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果如圖6所示。

通過對表面抗原P46基因的擴(kuò)增的新分離S株與其他12個(gè)菌種的相應(yīng)序列比對，堿基序列和氨基酸序列均具有高度同源性達(dá)99%以上，各菌株相互間氨基酸序列中有5處不同，分別為120、165、174、204和212位，其中S株在204位編碼的是谷酰胺(gln，Q)，而其他菌株均編碼丙氨酸(gla，A)，為S株所獨(dú)有。將P46基因的氨基酸序列作為依據(jù)，劃出各菌株的進(jìn)化樹和同源性關(guān)系圖，如圖7所示。

從進(jìn)化樹和同源性關(guān)系表可知，S株與7448株、IAF-2355-B-01株、IAF-669-00株、JNF65株等的情緣關(guān)系較近，同源性也最高。由于P46基因比較保守，菌株間的同源性均高達(dá)99%以上。

2.7 免疫原性測定 對家兔的免疫原性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對照組應(yīng)全部陰性(<1:5)，免疫組試驗(yàn)兔的IHA抗體效價(jià)不低于1∶20，結(jié)果見表1。

從上表可以看出，豬支原體肺炎S株試驗(yàn)疫苗免疫家兔后，IHA抗體效價(jià)可達(dá)到1∶40以上，與對照組差異顯著，綜合抗體水平略高于同類進(jìn)口疫苗抗體水平。

表1 家兔免疫后抗體IHA效價(jià)測定結(jié)果表

對豬的免疫原性攻毒后第14天對照組個(gè)別豬開始出現(xiàn)咳嗽癥狀，到剖檢前有3頭咳嗽、氣喘明顯；試驗(yàn)組攻毒后均未出現(xiàn)明顯的咳嗽。攻毒后28 d后剖檢，各組的豬支原體肺炎病變指數(shù)評分和保護(hù)力計(jì)算結(jié)果如表2。

圖6 S株Mhp P46基因推導(dǎo)的氨基酸序列與代表毒株比對分析

圖7 依照不同菌種的P46基因R1區(qū)氨基酸序列分析得出的進(jìn)化樹(A)和同源性比對表(B)

表2 仔豬攻毒后肺部病變情況

免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示豬支原體肺炎S株試驗(yàn)疫苗具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，達(dá)80%以上的水平，與進(jìn)口同類疫苗差別不明顯。由此表明豬肺炎支原體S株具有較好的免疫原性。

3 討論與小結(jié)

豬肺炎支原體是當(dāng)前最難分離的支原體種類之一，其對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求極其苛刻，而且可能受極易生長的豬鼻支原體和豬絮狀支原體的干擾，導(dǎo)致其分離率極低而不易成功。支原體鑒定方法中，除了菌落形態(tài)和生化鑒定外，最具排它性鑒別意義的是血清學(xué)鑒定，因?yàn)橹гw具有類似于病毒中和特性的代謝抑制特性，其為細(xì)菌所不具有的特殊性質(zhì)[15]。支原體的代謝抑制特性具有很強(qiáng)的種屬特異性，即針對一種支原體的高免血清只能抑制該種支原體的生長繁殖，而對其他種類的支原體不具有抑制作用，因而代謝抑制試驗(yàn)和生長抑制試驗(yàn)成為支原體鑒定中的金標(biāo)準(zhǔn)[16-18]。

在PCR檢測方面，16s RNA特異性引物PCR具有很強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，適合于進(jìn)行篩查和鑒別檢驗(yàn)[13]；多重PCR采用了4條引物，通過共用下游引物，同時(shí)檢測三種豬源支原體(包括豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬絮狀支原體)，適合于鑒別檢驗(yàn)，也可確定培養(yǎng)物是否污染其他兩種或一種支原體[10]。

P46是Mhp具有較強(qiáng)的種特異性蛋白，不存在于其他種類的支原體或其他微生物中，是豬肺炎支原體診斷試劑常用的備選蛋白。P46基因具有很強(qiáng)的保守性，不同菌株的核酸和氨基酸序列同源性均高達(dá)98%以上，適合用于豬肺炎支原體的鑒別[19-20]。P97蛋白是Mhp重要的表面粘附因子，及主要抗原蛋白，對造成機(jī)體支氣管上皮細(xì)胞和纖毛損傷有著重要的作用。P97蛋白的氨基酸序列中有兩個(gè)特殊的重復(fù)序列區(qū)，即由五個(gè)氨基酸[AA(V/T)PKE(V)]組成的R1區(qū)(位于N末端)和由10個(gè)氨基酸(GTPNQGKKAE)組成的R2區(qū)(位于C末端)，R1區(qū)的重復(fù)序列的數(shù)目因不同菌株而異，因此R1區(qū)重復(fù)數(shù)和其序列特征可作為辨別不同菌株的依據(jù)[21- 22]。豬肺炎支原體S株的R1區(qū)數(shù)目為11個(gè)，與國內(nèi)168株的數(shù)目相同，同源性也最高，是否可以說明該重復(fù)數(shù)存在地域上的關(guān)系，則需通過更多國內(nèi)分離株相應(yīng)數(shù)據(jù)加以說明。

本研究成功分離和鑒定了一株豬肺炎支原體菌株，通過對P46和P97 R1區(qū)進(jìn)行序列分析，并將其與GenBank及國內(nèi)文獻(xiàn)上的其他菌種氨基酸序列進(jìn)行比對，表明該菌株明顯區(qū)別于其他菌株。豬肺炎支原體S株在LPS生長滴度可穩(wěn)定可達(dá)109CCU/mL，通過免疫原性測定證明其具有較好的免疫原性，有望作為滅活疫苗株的備選菌種進(jìn)行后續(xù)研發(fā)。

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(編輯：侯向輝)

Isolation and Identification of Strain S of Mycoplasma hyopneumoniae

WEI Jing-jing1, LI Cong-yan1, SUN Ya-bo1, LI Qiu-ju3, SONG Xiao-ting1,LIU Fu-dong1, SHI Wen-yan1, NING Yi-bao2, SUN Ye1,2, SHEN Qing-chun1,2*

(1.BeijingZhonghaiBiotechCoLtd,Beijing100081,China；2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China；3.JilinHeyuanBioengineeringCoLtd,Songyuan,Jiiin138000,China)

10 lesioned lung tissues from typical swine mycoplasmosis were grinded, cleaned, and subjected to isolation, and a mycoplasma strain was obtained. The mycoplasma was proved to beMycoplasmahyopneumoniae(Mhp) by culture character, serological identification, biochemical identification, PCR test and sequencing. The purefied isolated strain was named Mhp strain S. Afterwards, Homology comparison was performed on genetic sequence and amino acid sequence of P46 and P97 R1 region with the available sequence of other strains, the results show that the amino acid sequence of P46 gene is more than 99% homology with other strains, the number of P97 R1 region amino acid repeat sequence of the Mhp strain S is 11, different from other strains. The immunogenicity test results showed that the isolation strain had good immunogenicity.

Mycoplasmahyopneumoniae; isolation; test; identification

魏晶晶，從事獸用生物制品的科研和管理工作。

沈青春。E-mail:shenqingchun@ivdc.org.cn

2015-12-28

A

1002-1280 (2016) 02-0015-07

S852.62