白玉惠，王鶴佳，劉智宏，黃耀凌，徐士新

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

新型喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物人工半抗原的設(shè)計(jì)及其在動(dòng)物組織殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

白玉惠，王鶴佳，劉智宏*，黃耀凌，徐士新

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為提高酶聯(lián)免疫方法測(cè)定喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物(MQCA)的檢測(cè)性能，設(shè)計(jì)了一種新型MQCA人工半抗原，該半抗原既完整保留MQCA分子特征性基團(tuán)和結(jié)構(gòu)，又具有便于和蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的基團(tuán)-NH2。通過(guò)三步化學(xué)反應(yīng)合成該半抗原，將其與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)成為免疫抗原后，進(jìn)一步制備特異性抗體,研制了MQCA酶聯(lián)免疫試劑盒，靈敏度高，特異性好，IC50為1.94 μg/L。建立了測(cè)定動(dòng)物性產(chǎn)品中MQCA殘留量的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，測(cè)定豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋中MQCA的檢測(cè)限分別為0.42、0.23、0.28、0.28 μg/kg。豬肉中不同添加濃度MQCA(1, 2, 4 μg/kg)的回收率為70%～97%；批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于12%。本試劑盒可同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品，有望在MQCA殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。研究有助于指導(dǎo)小分子藥物半抗原的合理設(shè)計(jì)，為現(xiàn)有的半抗原設(shè)計(jì)方法提供新的理念和思路。

喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物；半抗原設(shè)計(jì)；酶聯(lián)免疫分析；殘留檢測(cè)

喹乙醇(OLA)，分子式C12H13N3O4，是喹噁啉類抗菌藥物的典型代表，其主要代謝物為3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)。由于OLA對(duì)大多數(shù)動(dòng)物有明顯的致畸作用，對(duì)人也有潛在的三致性，即致畸、致突變和致癌[1-2]，很多國(guó)家規(guī)定禁止或限制使用OLA。作為指定的主要?dú)埩魳?biāo)志物，MQCA用于監(jiān)控OLA在畜牧生產(chǎn)中的違禁使用情況。利用儀器方法檢測(cè)MQCA的技術(shù)相對(duì)復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高[3-5]，而酶聯(lián)免疫方法(ELISA)具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、有效等優(yōu)點(diǎn)，能滿足目前生產(chǎn)鏈所需要的大量樣本的快速篩選和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。

目前已有檢測(cè)MQCA方法主要是直接在MQCA分子的-COOH位置設(shè)計(jì)改造抗原[6]。這種偶聯(lián)情況下，MQCA的部分特征性基團(tuán)和結(jié)構(gòu)(-COOH、氮雜環(huán))很可能不能充分暴露作為B淋巴細(xì)胞的抗原表位，進(jìn)而影響抗體靈敏度或特異性。因此，連接位點(diǎn)的選擇對(duì)于抗體質(zhì)量至關(guān)重要，這就要求對(duì)半抗原進(jìn)行科學(xué)合理的設(shè)計(jì)與改造。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 OLA，MQCA，喹噁啉-2-羧酸(QCA)，乙酰甲喹，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，人血清蛋白(HSA)，吐溫20，甘油，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，西格瑪化學(xué)試劑公司(北京)?？ò脱酰┩?，百靈威科技有限公司。全脂奶粉,Becton-Dickingson 公司(美國(guó))。四甲基聯(lián)苯胺, 硫酸(H2SO4),北京化學(xué)試劑公司。去離子水由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore, MA)純化制備。其它試劑均為分析純，使用前未經(jīng)純化。

ELISA測(cè)定通過(guò)sunrise酶標(biāo)儀完成，核磁共振氫譜通過(guò)瑞士BRUKER DRX300MHz核磁共振儀完成，所用液質(zhì)聯(lián)用儀為島津LC-MS 2020。1.2 (緩沖)溶液體系 使用的(緩沖)溶液包括：(1)包被緩沖液：0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)；(2)PBS緩沖液(pH7.2)：含有0.01mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉的水溶液；(3)洗滌液：含有0.05%(質(zhì)量百分含量)吐溫-20的PBS緩沖液；(4)顯色液A：濃度為1 mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液(溶劑為二甲基甲酰胺)；(5)顯色液B：含有0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸的水溶液，pH5.0；(6)終止液：1 mol/L硫酸溶液。

1.3 半抗原的合成 喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物人工半抗原分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，既完整保留MQCA分子特征性基團(tuán)和結(jié)構(gòu)，同時(shí)又具有氨基(-NH2)便于和蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，該半抗原簡(jiǎn)稱為AMQCA。

圖1 半抗原分子AMQCA結(jié)構(gòu)圖

半抗原分子的合成路線如圖2所示。

(1)將650 mg乙酰乙酸乙酯溶于20 mL蒸餾水，加入N-溴代丁二酰亞胺(NBS)1.06 g，再加入4-硝基鄰苯二胺750 mg，反應(yīng)過(guò)夜。用乙酸乙酯萃取，濾液減壓蒸干得化合物2。(2)取500 mg化合物2溶于無(wú)水乙醇15 mL，加入氯化亞錫570 mg，室溫反應(yīng)4 h。加入20 mL 1mol/L NaOH 溶液，二氯甲烷萃取，濾液減壓蒸干，得化合物3。(3)取230 mg化合物3溶于甲醇和水(5 mL∶2 mL)的混合溶液，加入氫氧化鋰120 mg，室溫反應(yīng)過(guò)夜。減壓蒸干得化合物4，即圖1所示產(chǎn)物AMQCA。

分別采用LC-MS和核磁共振方法表征制備的半抗原。

圖2 喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物半抗原的合成路線圖

1.4 人工免疫抗原的合成 將25 mg AMQCA溶于2 mL水，加入2 mL 1 mol/L鹽酸水溶液，然后依次加入20 mg亞硝酸鈉和200 mg人血清白蛋白，混勻，于2～8 ℃及120 r/min條件下攪拌反應(yīng)2 h，然后在PBS緩沖液中透析以除去未與蛋白結(jié)合的AMQCA。將制備的AMQCA-HSA保存于-20oC備用，結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3。采用紫外可見(jiàn)吸收光譜(UV-vis)對(duì)制備的免疫抗原進(jìn)行表征，以確定是否偶聯(lián)成功，并計(jì)算半抗原/蛋白質(zhì)的分子結(jié)合比。

圖3 喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物人工抗原的結(jié)構(gòu)示意圖

1.5 酶結(jié)合物的制備 將5 mg AMQCA溶于1 mL水，然后逐滴加入0.5 mL EDC水溶液(含5 mg EDC)和0.5 mL NHS水溶液(含3 mg NHS)并混勻，于4℃攪拌5 min，加入1 mL 20 mg/mL HRP溶液(將辣根過(guò)氧化物酶溶于PBS緩沖液，得到HRP溶液)并于4 ℃、120 r/min攪拌反應(yīng)16 h，在生理鹽水中透析，得到酶標(biāo)抗原AMQCA-HRP濃溶液，用等體積甘油稀釋后，-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 動(dòng)物免疫 動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格遵循北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查條例(2005)，以及涉及動(dòng)物的生物醫(yī)學(xué)研究的國(guó)際指導(dǎo)準(zhǔn)則(1985)，并經(jīng)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)同意。試驗(yàn)過(guò)程盡量做到減輕動(dòng)物痛苦，減少動(dòng)物數(shù)量。

采用3只新西蘭大耳兔(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)作為免疫動(dòng)物，以制備的AMQCA-HSA人工抗原為免疫原。首次免疫用乳液按照如下方法配制：2 mL濃度為2 mg/mL(以蛋白濃度計(jì))的免疫原水溶液與2 mL完全弗氏佐劑乳化。加強(qiáng)免疫用乳液按照以下方法配制：2 mL濃度為2 mg/mL(以蛋白濃度計(jì))的免疫原水溶液與2 mL不完全弗氏佐劑乳化。首次免疫采用背部皮下多點(diǎn)注射以及后腳掌趾間注射(免疫原的劑量為1 mg /只)；加強(qiáng)免疫采用大腿肌肉注射(免疫原的劑量為0.5 mg /只)，每次免疫間隔2周，最后一次不加免疫佐劑直接肌肉注射，最后一次加強(qiáng)免疫7 d后采血，收集血清，即為多克隆抗體。

1.7 用棋盤(pán)滴定法確定抗體及酶結(jié)合物效價(jià) 分別取來(lái)自3只兔子的多克隆抗體，用包被緩沖液梯度稀釋，得到系列抗體稀釋液。在酶標(biāo)板每孔分別加入150 μL上述抗體稀釋液，37 ℃靜置2 h，然后4 ℃靜置12 h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，拍干。每孔加入250 μL含5%(質(zhì)量百分含量)脫脂牛奶的PBS緩沖液，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，干燥。取上述酶標(biāo)板，分別加入0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(即PBS緩沖液)和含10 ng/mL MQCA的PBS緩沖液(50 μL/孔)，然后每組再分別加入100 μL系列稀釋酶標(biāo)抗原溶液，混勻并靜置孵育30 min。用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次并用吸水紙拍干，每孔加入100 μL顯色液并避光顯色15 min，最后每孔加入100 μL終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光值(A450值)。

加入0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的孔的吸光度值為B0。加入含10 ng/mL MQCA的PBS緩沖液的孔的吸光度值為B。B0大于1.5且抑制率為50%以上判斷為陽(yáng)性。百分吸光度值越低，抗體靈敏度越高。按此要求血清抗體效價(jià)達(dá)1∶5000。選取3只兔子中效果最好的血清抗體用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

抑制率(%) = [1-(B/B0)] × 100%

1.8 直接競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定 取制備好的多克隆抗體，用包被緩沖液稀釋，得到蛋白濃度為0.2 μg/mL的溶液。在酶標(biāo)板每孔分別加入150 μL抗體稀釋液，37℃靜置2 h，然后4 ℃靜置12 h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，拍干。每孔加入250 μL含5%(質(zhì)量百分含量)脫脂牛奶的PBS緩沖液，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，干燥。每孔加入50 μL MQCA標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度分別為：0、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μg/L)，然后每孔加入100 μL酶標(biāo)抗原溶液(0.1 mg/L)，并于室溫孵育30 min。用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次并用吸水紙拍干，每孔加入100 μL顯色液并避光顯色15 min，最后每孔加入100 μL終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光值(A450值)。1.9 特異性測(cè)定 選擇與MQCA結(jié)構(gòu)和功能類似的5種藥物，將MQCA配制成如下濃度：0、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μg/L，其它5種類似藥物配制成如下濃度：0、10、30、100、300、1000 μg/L。用本試劑盒按照上述直接競(jìng)爭(zhēng)免疫法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各藥物50%抑制濃度，與MQCA50%抑制濃度相比，得出一系列交叉反應(yīng)率(CR)，按以下公式計(jì)算：

CR (%) = (IC50,MQCA/IC50,類似物) × 100%

1.10 豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋樣品檢測(cè)限測(cè)定 用制備的試劑盒測(cè)定各個(gè)空白樣品(已確認(rèn)不含MQCA的豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋，各20份)的A450值，每個(gè)樣品進(jìn)行2次重復(fù)取平均值。將各樣品的A450平均值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(0、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μg/L)中，獲得各樣品中的測(cè)定值，按測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算檢測(cè)限。

豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋樣品前處理方法如下：稱取2(±0.02)g均質(zhì)樣品至50 mL離心管中，加入8.0 mL乙酸乙酯，渦旋混勻；加入4 mL 1.5 mol/L鹽酸水溶液，渦旋混勻，用振蕩器振蕩5 min，5000 r/min室溫離心5 min；取5 mL上清液至另一50 mL離心管中，加入3 mL 33.3%(質(zhì)量百分比)NaCl水溶液，渦旋混勻，5000 r/min室溫離心5 min；取4.0 mL上清液至10 mL干凈玻璃試管中，于50 ℃～60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑辉诓Ａг嚬苤屑尤? mL正己烷，渦旋溶解干燥殘留物，然后加入1 mL水，渦旋混勻，靜置分層；除去上層有機(jī)相，取下層水相，用水稀釋至兩倍體積，即為待測(cè)樣本溶液。

1.11 添加回收試驗(yàn) 空白豬肉樣品中分別添加MQCA使其濃度為1.0、2.0、4.0 μg/kg，每個(gè)濃度分別制備6個(gè)樣品，采用上述前處理方法進(jìn)行處理后，用ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。

添加回收率(%)計(jì)算公式如下：

回收率=實(shí)測(cè)值/添加值×100%

2 結(jié)果

2.1 半抗原的鑒定 LC-MS圖譜結(jié)果如下，(ESI, m/z)：204 [M+H]+。圖譜中，得到m/z 比為204的主峰，對(duì)應(yīng)半抗原的[M+H]+。

核磁共振圖譜如圖4所示，1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.71 (d,J= 9.0 Hz, 1 H), 7.29 (dd,J= 9.0, 1.8 Hz, 1H), 6.92 (d,J= 1.8 Hz, 1H), 6.13 (br, 2H), 2.68 (s, 3H)。氫化學(xué)位移值、質(zhì)子的裂分峰數(shù)與半抗原相一致。

以上結(jié)果表明，半抗原的結(jié)構(gòu)式為圖1所示。

圖4 喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物半抗原的核磁共振氫譜

2.2 人工抗原的鑒定 AMQCA與載體蛋白HSA通過(guò)重氮化反應(yīng)偶聯(lián)。為了證明偶聯(lián)成功，分別對(duì)AMQCA溶液(a)、HSA溶液(b)以及AMQCA-HSA溶液(c)進(jìn)行紫外(250～400 nm)光譜掃描，發(fā)現(xiàn)吸收峰有明顯變化，見(jiàn)圖5。

圖5 紫外可見(jiàn)光譜 (a) AMQCA (b) HSA (c) AMQCA-HSA

2.3 試劑盒檢測(cè)限、靈敏度、特異性、精密度和準(zhǔn)確度

2.3.1 試劑盒檢測(cè)限 在不含MQCA的豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋各20份空白樣品的測(cè)定基礎(chǔ)上，計(jì)算得到該ELISA方法在豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋中的檢測(cè)限分別為0.42、0.23、0.28、0.28 μg/kg。

2.3.2 試劑盒靈敏度 50%抑制濃度(即IC50，指0 μg/L吸光度值的50%處所對(duì)應(yīng)的MQCA濃度)常作為評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒靈敏度的指標(biāo)。用試劑盒分別測(cè)定5次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50在1.8～2.1 μg/L范圍之內(nèi)，平均值為1.94 μg/L。本試劑盒抑制曲線和標(biāo)準(zhǔn)校正曲線見(jiàn)圖6。

圖6 試劑盒抑制曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(B)(每個(gè)點(diǎn)為重復(fù)5次測(cè)定的平均值)

2.3.3 試劑盒特異性 特異性測(cè)定結(jié)果如表1所示，表明該試劑盒能特異性測(cè)定MQCA而不受其它類似物干擾。

表1 試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 精確度和準(zhǔn)確度 通過(guò)添加回收試驗(yàn)，對(duì)該方法的精確度和準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)估。批內(nèi)變異系數(shù)是通過(guò)測(cè)定6個(gè)平行樣品計(jì)算得到，批間變異系數(shù)是3個(gè)不同批次試劑盒分別測(cè)定6個(gè)平行樣品計(jì)算得到。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論與小結(jié)

3.1 半抗原AMQCA的優(yōu)點(diǎn) 眾所周知，小分子由于不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答而不具備免疫原性。因此，AMQCA不能直接用作免疫抗原，而是需要與蛋白質(zhì)載體連接。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的半抗原AMQCA與MQCA結(jié)構(gòu)相似，唯一區(qū)別在于苯環(huán)上遠(yuǎn)離-COOH的位置多一個(gè)-NH2。將AMQCA作為半抗原具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)完整保留MQCA分子特征性基團(tuán)和結(jié)構(gòu)(氮雜環(huán)、-COOH等)；(2)具有便于和蛋白質(zhì)載體進(jìn)行偶聯(lián)的基團(tuán)-NH2；(3)特征性基團(tuán)和結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離偶聯(lián)位置，不容易受到蛋白質(zhì)載體屏蔽，可充分暴露而成為抗原表位，利于高靈敏度和特異性抗體的制備。

表2 豬肉精確度和準(zhǔn)確度的試驗(yàn)結(jié)果

3.2 半抗原與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián) 紫外可見(jiàn)光譜(圖5)中，AMQCA在260 nm處具有很大的吸收峰，這可能是由于其分子中具有較多共軛結(jié)構(gòu)(-C=C-，-C=O，-C=N-)。HSA在278 nm處的吸收峰來(lái)自于分子中色氨酸和酪氨酸殘基[7]。對(duì)于AMQCA-HSA，偶聯(lián)形成的-N=N-將半抗原和蛋白質(zhì)連接起來(lái)，同時(shí)也將各個(gè)共軛體系連接，導(dǎo)致340 nm附近新的吸收寬峰的出現(xiàn)。此外，根據(jù)先前報(bào)道的方法[8-9]，計(jì)算半抗原AMQCA和人血清白蛋白的偶聯(lián)比為8∶1，即8個(gè)半抗原分子結(jié)合1個(gè)人血清白蛋白。

3.3 MQCA試劑盒的性能 將制備的抗體用于ELISA試劑盒的研制，其各方面性能均良好。IC50比已有報(bào)道的ELISA方法的IC50降低2～3倍[6,10-11]。與文獻(xiàn)[6]報(bào)道直接在MQCA分子的-COOH位置設(shè)計(jì)改造抗原并在此基礎(chǔ)上建立測(cè)定動(dòng)物可食性組織中MQCA的ELISA方法相比，本方法在豬肉中測(cè)定MQCA的檢測(cè)限降低了8倍，在雞肉中測(cè)定MQCA的檢測(cè)限降低了6倍。此外，本方法在豬肝中測(cè)定MQCA的檢測(cè)限比Shen等[10]方法降低2.4倍，并且與HPLC-MS/MS方法測(cè)定雞組織中MQCA的檢測(cè)限具有可比性[12]。

本方法特異性高，抗體對(duì)MQCA高度敏感(CR為100%)，而對(duì)QCA稍有反應(yīng)(CR為3.6%)，但是對(duì)乙酰甲喹、喹乙醇、卡巴氧、喹烯酮等幾乎無(wú)反應(yīng)(CR<0.1)，因此測(cè)定MQCA時(shí)不受類似物(例如QCA)干擾。可能的原因有以下兩個(gè)：第一，設(shè)計(jì)的半抗原AMQCA與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)后，由于偶聯(lián)位置遠(yuǎn)離分子特征性基團(tuán)和結(jié)構(gòu)，氮雜環(huán)、-COOH以及-CH3不容易受到蛋白質(zhì)載體屏蔽，仍能同時(shí)暴露而成為抗原表位；第二，從結(jié)構(gòu)上看，MQCA比QCA的-COOH鄰位多一個(gè)-CH3，導(dǎo)致抗體對(duì)MQCA以及QCA反應(yīng)率相差迥異。Jiang等[6]在MQCA分子的-COOH上接入間隔臂后偶聯(lián)載體蛋白作為抗原，制備的抗體對(duì)具有喹噁啉母環(huán)結(jié)構(gòu)的多種藥物均有反應(yīng)，這也從另一個(gè)方面說(shuō)明本文設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)能大大提高抗體特異性，并且本方法解決了上述文獻(xiàn)中假陽(yáng)性率高的問(wèn)題。

此外，該試劑盒測(cè)定豬肉中1.0、2.0和4.0 μg/kg MQCA添加濃度的回收率范圍為70%～97%，批內(nèi)變異系數(shù)CV≤12%，批間變異系數(shù)CV≤12%。說(shuō)明本方法的精確度和準(zhǔn)確度能夠滿足要求，并且具有較好地重現(xiàn)性和可重復(fù)性。

本文設(shè)計(jì)了一種新型MQCA人工半抗原，該半抗原既完整保留分子特征性基團(tuán)和結(jié)構(gòu)并使其充分暴露而成為抗原表位，同時(shí)又具有連接基團(tuán)便于和蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)制備人工抗原，進(jìn)而利于高靈敏度和特異性抗體的制備。人工半抗原合成原料試劑簡(jiǎn)單、低廉，易于購(gòu)買,采用的化學(xué)反應(yīng)安全，易于操作。制備的特異性抗體用于MQCA酶聯(lián)免疫試劑盒，建立了測(cè)定動(dòng)物性產(chǎn)品中MQCA殘留量的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法。該方法具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，可同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品，有望在MQCA殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。更重要地，本研究有助于指導(dǎo)小分子藥物半抗原的合理設(shè)計(jì)，為現(xiàn)有的半抗原設(shè)計(jì)方法提供新的理念和思路。

[1] Zhang K, Ban M, Zhao Z,etal. Cytotoxicity and genotoxicity of 1,4-bisdesoxyquinocetone, 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA) in human hepatocytes [J]. Res. Vet. Sci. 2012, 93: 1393-1401.

[2] Bi Y, Wang X, Xu S,etal. Metabolism of olaquindox in rat and identification of metabolites in urine and feces using ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry [J]. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2011, 25: 889-898.

[3] Wu Y, Yu H, Wang Y,etal. Development of a high-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues [J]. J. Chromatogr. A, 2007, 1146, 1-7.

[4] Boison J O, Lee S C, Gedir R G. A determinative and confirmatory method for residues of the metabolites of carbadox and olaquindox in porcine tissues [J]. Anal. Chim. Acta, 2009, 637: 128-134.

[5] Merou A, Kaklamanos G, Theodoridis G. Determination of carbadox and metabolites of carbadox and olaquindox in muscle tissue using high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. J. Chromatogr. B, 2012, 882: 90-95.

[6] Jiang W X, Beier R C, Wang Z H,etal. Simultaneous screening Analysis of 3 Methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid and quinoxaline-2-carboxylic acid residues in edible animal tissues by a competitive indirect immunoassay [J]. J. Agric. Food Chem. 2013, 61: 10018-10025.

[7] Yang L G, Hu S Y, Wei P H,etal. Enzyme immunoassay technology [M]. Nanjing: Nanjing University Press, 1998.

[8] Bai Y H, Liu Z H, Bi Y F,etal. Preparation of polyclonal antibodies and development of a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues of phenylethanolamine A in urine samples [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60: 11618-11624.

[9] Jiang J, Wang Z, Zhang H,etal. Monoclonal antibody-based ELISA and colloidal gold immunoassay for detecting 19-nortestosterone residue in animal tissues [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 9763-9769.

[10]Shen J, Wang Z, Jiang W,etal. A sensitive and specific ELISA for determining a residue marker of three quinoxaline antibiotics in swine liver [J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2013, 405(8): 2653-2659.

[11]Yue N, Ji B Q, Liu L Q,etal. Synthesis of olaquindox metabolite, methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid for development of an immunoassay [J]. Food and Agricultural Immunology, 2009, 20(2): 183-193.

[12]Liu Y, He L, Xu L,etal. Simultaneous determination of quinocetone and its major metabolites in chicken tissues by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. Journal of chromatography B, 2013, 919/920: 30-37.

(編輯：陳希)

A Novel Hapten Design for Marker Residue of Olaquindox and Its Application on the Veterinary Residue Detection in Animal Tissues

BAI Yu-hui, WANG He-jia, LIU Zhi-hong*, HUANG Yao-ling, XU Shi-xin

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

In order to improve the detection performance of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for maker residue of Olaquindox (MQCA), a novel hapten of MQCA was designed. This hapten keeps the characteristic structure and goups of MQCA, additionally, it can be easily coupled with protein carrier according to its -NH2. The hapten was synthesized involving in three steps. Based on its coupling with protein to become the immunogen, polyclonal antibodies were prepared. A rapid direct competitive ELISA was established to detect MQCA in animal tissues. The antibody showed high sensitivity and high specificity, with the IC50being 1.94 μg/L. The limits of detection of MQCA in liver, pork, chicken, and egg were 0.42, 0.23, 0.28 and 0.28 μg/kg, respectively. The average recoveries ranged from 70% to 97% at different spiked levels (1, 2 and 4 μg/kg) in pork for MQCA, and the intra/inter-day coefficients of variation were below 12%. The prototype kit could be advantageously used for the screening of large groups of samples, and has potential to play important role in the detection of MQCA. In addition, this study may help to guide the antigen design of small molecule medicine more reasonably, and supply new concept for the hapten design.

maker residue of Olaquindox; Hapten Design; ELISA; residue detection

白玉惠，博士，從事獸藥殘留檢測(cè)方法研究及試劑盒研發(fā)工作。

劉智宏。E-mail: liuzhihong@ivdc.org.cn

2015-12-02

A

1002-1280 (2016) 02-0022-07

S859.84