李家旭，葉繼丹

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；

2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021）

斜帶石斑魚牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆及飼料?；撬岷繉ζ浔磉_的影響

李家旭1,2，葉繼丹1,2

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；

2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021）

?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白（Taurine transporter，TauT）是?；撬峥缒まD(zhuǎn)運的重要載體，在魚類的生長、代謝及性成熟過程中發(fā)揮重要作用。本文采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆體質(zhì)量（12.85±0.46）g的斜帶石斑魚Epinephelus coioides TauT cDNA蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列。結(jié)果表明：斜帶石斑魚TauT cDNA蛋白質(zhì)編碼區(qū)為1 881bp，編碼626個氨基酸，分子量為70 126.80Da，與已克隆的其他魚類的同源性很高，而與鳥類和哺乳動物的同源性較低。在水溫（27±2）℃下，給斜帶石斑魚投喂含牛磺酸0%、0.5%、1%和1.5%的飼料28d后，用Realtime PCR法檢測不同組織中TauTmRNA的相對表達量，結(jié)果表明：TauTmRNA在所測的各組織中均有表達，但肝臟、心臟、腦表達水平最高，腎臟、鰓、脾臟次之，腸道、肌肉、脂肪組織最低。?；撬崽砑咏M中組織TauT mRNA的表達量均高于對照組，1.0%和1.5%兩組間差異不明顯，但均高于0.5%組。飼料中添加?；撬崮艽龠M斜帶石斑魚組織中TauTmRNA的表達。

斜帶石斑魚；?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白；同源性分析；基因表達

?；撬幔?-氨基乙磺酸）又稱牛膽堿或牛膽素，廣泛存在于動物可興奮組織細胞內(nèi)，是一種含量豐富的游離β-氨基酸[1]，具有保護生物膜[2,3]、參與膽汁酸合成[4]、調(diào)節(jié)滲透壓[5]、神經(jīng)中樞、抗氧化與免疫、解毒、促進營養(yǎng)物質(zhì)代謝[6]和發(fā)育繁殖[7]等生物學(xué)功能?？缒まD(zhuǎn)運是?；撬岚l(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)，缺血、缺氧及組織損傷時細胞內(nèi)牛磺酸大量漏出，促進了組織損傷發(fā)展[8]。在飼料中補充適量?；撬峥梢燥@著提高大菱鲆Scophthalmus maximus、真鯛Pagrosomus major、褐牙鲆Paralichthys olivaceus等魚類的生長性能，而飼料中缺乏?；撬釙r鰣Tenualosa reevesii生長遲緩，出現(xiàn)綠肝綜合癥[7]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細胞內(nèi)牛磺酸的濃度是10mmol/kg，而在血漿中高達20～100μmol/L[1]，這表明?；撬崾菑难獫{逆梯度主動跨膜轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)[9]。

魚類?；撬岬目缒まD(zhuǎn)運都是依靠細胞膜上的牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白（TauT）[10,11]。Roig-pérez等[12]發(fā)現(xiàn)，?；撬嵬ㄟ^TauT轉(zhuǎn)運進入人腸上皮Caco-2細胞，抑制產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物；敲除TauT基因后，血清中丙二醛、一氧化氮和過氧化氫的水平升高，使腸道產(chǎn)生嚴重氧化應(yīng)激反應(yīng)。Ito等[13]報道，敲除TauT基因增加了細胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，使許多肌肉組織嚴重病變。這些研究表明：TauT對運輸?；撬嵋约罢{(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)具有重要作用。目前有關(guān)牛磺酸與哺乳動物TauT關(guān)系的研究較多，而對魚類的相關(guān)研究較少，僅對大西洋鮭Salmo salar、莫桑比克羅非魚Oreochromis mossambicus、斑馬魚Danio rerio、鯉Cyprinus carpio、花鱸Lateolabrax japonicus等魚類的TauT基因進行克隆及表達研究。有關(guān)在飼料中添加?；撬岬乃綄κ唪~TauT mRNA表達的影響尚未見報道。本實驗利用RT-PCR方法和RACE方法克隆并測定斜帶石斑魚Epinephelus coioides TauT基因，應(yīng)用Real-time PCR方法測定攝食含不同水平?；撬犸暳系男睅唪~TauT mRNA在不同組織中的表達水平，進一步研究TauT的性質(zhì)和作用，可為牛磺酸在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的合理應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用斜帶石斑魚購自廈門一家石斑魚養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為（12.85±0.46）g。

1.2 總RNA提取與cDNA第一條鏈合成

參照Trizol Reaget（Invitrogen）說明書提取斜帶石斑魚各組織總RNA；參照Thermo試劑盒使用方法合成cDNA第一條鏈。實驗在無菌低溫下進行。

1.3 擴增同源序列

根據(jù) NCBI GenBank中已克隆的 鱸（JN897395）、大西洋（NP-001117102）、羅非魚（AB033497.1）序列，設(shè)計簡并引物（LY-TauT-F，LY-TauT-R），以 cDNA第一條鏈為模板，以LY-TauT-F和LY-TauT-R為引物進行同源序列擴增。反應(yīng)條件為95℃3min；30個循環(huán)（95℃30s；50℃60s；72℃30s）；72℃8min。將PCR產(chǎn)物進行膠回收，連接載體轉(zhuǎn)化測序。引物序列見表1。

1.4 全長cDNA克隆

根據(jù)所得同源序列，設(shè)計 RACE引物（TauT-3F1、TauT-3F2、TauT-5R1和TauT-5R2）。引物序列見表1。

3’末端的擴增：20μL反應(yīng)體系中有10×Taq buffer 2μL、dNTP（3.2mM）1.6μL、TauT-3F1和AOLP各0.5μL、模板cDNA 1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL，用雙蒸水補充到20μL。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃45s，30個循環(huán)。第一輪PCR擴增后，在20μL反應(yīng)體系中加入第一輪稀釋50倍的PCR產(chǎn)物1μL、引物AP和TauT-3F2進行第二輪擴增。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃30s，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序。

5’末端的模板：以Random引物為反轉(zhuǎn)錄引物啟動逆轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA經(jīng)純化試劑盒純化后，用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA 3’末端加上poly C尾（0.2mL PCR管中加入如下反應(yīng)體系：6.5μL滅菌雙蒸水，5μL 5×TdT Buffer，2.5μL dCTP（2mM），10μL純化的cDNA第一條鏈。94℃3min，短暫離心后冰上放置2min，加入1μL末端轉(zhuǎn)移酶（TdT），終體積25μL，混勻后離心37℃15min，65℃10min滅活末端轉(zhuǎn)移酶。以加過尾的dC-cDNA為模板，運用接頭引物和基因特異性引物進行擴增。

5’末端的擴增：在20μL反應(yīng)體系中加入10× Taq buffer 2μL、dNTP（3.2mM）1.6μL、引物AAP和TauT-5R1各0.5μL、模板1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL。 反 應(yīng) 條 件 ：94℃ 5min；94℃ 45s，68℃30s，72℃2min 30s，15個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度下降1℃；最后94℃45s，53℃30s，72℃2min 30s，24個循環(huán)。第一輪PCR擴增后，在20μL體系中加入第一輪稀釋50倍的PCR產(chǎn)物1μL、引物AP和TauT-5R2進行第二輪擴增。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃2min，30個循環(huán)。將PCR結(jié)果進行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序。

1.5 氨基酸序列比較與同源性分析

采用NCBI網(wǎng)站的BLAST（http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）工具比對序列同源，分析相似性；采用SeqMan和EDitSeq軟件進行序列的拼接及編碼序列分析等；采用CLUSTALW程序（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進行多序列比對；經(jīng)在線軟件 http://www.cbs.dtu.Dk/services/TMHMM/對TauT蛋白跨膜區(qū)域進行預(yù)測；采用MEGA 6軟件用鄰位相接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，用Bootstrap法進行1 000次評估。

1.6 TauT mRNA組織表達差異分析

從暫養(yǎng)缸中隨機取石斑魚，麻醉后置于冰盤上，在無菌操作臺中解剖采集心臟、腦、鰓、肝臟、腸、脾臟、腎臟、脂肪和肌肉等樣品，置于液氮中保存，用于提取總RNA以及合成cDNA第一條鏈。根據(jù)所得到的序列設(shè)計熒光定量引物F1和R1，通過引物檢測，進行熒光定量實驗。采用SYBRGreen I嵌合熒光法，使用SYBRGreen Master Mix試劑（AceQqPCR，南京諾唯贊生物科技有限公司），在Thermal cycler儀（ABI StepOne PlusTM）上進行操作。引物序列見表1。

1.7 攝食含不同水平?；撬犸暳系氖唪~組織表達差異的測定

以玉米淀粉為淀粉源，明膠和酪蛋白作為蛋白源，魚油、大豆油以及大豆卵磷脂作為脂肪源，結(jié)晶纖維素作為填充劑，分別配制?；撬崽砑恿繛?（D1）、0.5%（D2）、1%（D3）和1.5%（D4）的4組實驗飼料。斜帶石斑魚暫養(yǎng)10d后，選取400尾規(guī)格相近且體況良好的幼魚，初始體質(zhì)量為（13.85±0.25）g，隨機分配到16個體積為120L的循環(huán)水族箱中，每箱25尾，每4個水族箱一組，分別飽食投喂實驗飼料28d。養(yǎng)殖期間水溫為（27±2）℃，溶解氧（6.15±0.45）mg/L，硝酸鹽氮（0.248±0.15）mg/L。

飼養(yǎng)實驗結(jié)束時，按前述操作方法采集、檢測各組織樣品中TauT mRNA的相對表達量，參照1.6分析TauTmRNA組織表達差異。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

按下式計算增重率（WGR，%）：

WGR（%）=100×（Wt-W0）/W0，

公式中：W0和Wt分別為實驗開始和結(jié)束時每尾魚的平均體質(zhì)量（g）；t為養(yǎng)殖實驗天數(shù)。

采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達量[14]。在不同組織表達差異分析中，以脂肪表達量為對照，設(shè)其基因的相對表達量為1。飼料?；撬嵴T導(dǎo)實驗的基因表達分析中，以牛磺酸添加量0（D1）的表達量為對照，設(shè)其基因的相對表達量為1。用SPSS 17對實驗結(jié)果進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤（Mean±SE）表示，若存在顯著差異時，采用Student-Newmnan-Keuls法進行多重比較，顯著性差異水平表示為P＜0.05。

表1 本文所用引物序列Tab.1 Sequence of the primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 斜帶石斑魚TauT cDNA序列分析

本實驗克隆了斜帶石斑魚TauT基因ORF區(qū)域全長（Gene Bank登錄號KX226453）為1 881bp，全部編碼626aa，預(yù)測的分子質(zhì)量為70 126.80Da，理論等電點約為7.834。該核苷酸及氨基酸序列提交GenBank經(jīng)Blast比對顯示，該序列與其他物種的TauT均具有較高的同源性，故推斷本實驗獲得的ORF區(qū)域序列為編碼斜帶石斑魚TauT的ORF區(qū)域序列。

2.2 斜帶石斑魚TauT氨基酸序列分析

斜帶石斑魚TauT氨基酸序列與已經(jīng)登陸NCBI的鱸（AFC36524.1）、斑馬魚（NP_001032750.1）、大西洋鮭（NP_001117102.1）、鯉（BAA89537.1）、羅非魚（BAB18038.1）、雞（NP_001025771.2）、人（NP_003034.2）、牛（NP_777035.1）、大鼠（NP_058902.1）和小鼠（NP_033346.2）等的TauT氨基酸結(jié)構(gòu)進行比較發(fā)現(xiàn)，它們都有12個跨膜區(qū)域，在第三跨膜區(qū)域與第四跨膜區(qū)域之間有一個親水基環(huán)。這個環(huán)含有三個潛在的N-糖基化位點，分別為N-179、N-187和N-190。斜帶石斑魚TauT蛋白12個跨膜區(qū)域的位置如圖1所示，并與上述物種所在位置大致相同，且第三跨膜區(qū)（122～144）與第四跨膜區(qū)（218～236）之間有一個大親水環(huán)。這表明不同物種TauT的結(jié)構(gòu)相似性很高。

圖1 斜帶石斑魚TauT蛋白的膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Prediction of TauT protein membrane structure in grouper

2.3 斜帶石斑魚TauT同源性分析和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

圖2系統(tǒng)進化樹主要分為2支：一支為魚類，另一支為鳥類和哺乳類。本研究選擇的物種主要分為3個單系類群：斜帶石斑魚和鱸、斑馬魚、大西洋鮭、鯉、羅非魚等魚類聚為一支，為第一類群，其中斜帶石斑魚和鱸優(yōu)先聚為一支，表明它們的親緣關(guān)系最近；鳥類為第二類群；人、牛、大鼠、小鼠等哺乳動物組成第三類群。由表2可知，斜帶石斑魚TauT與鱸同源性最高，達到92.69%，與其他魚類的同源性相似，均在80%以上。盡管斜帶石斑魚與鳥類和哺乳類同源性較低，但也都在75%以上，這說明斜帶石斑魚TauT基因在魚類、鳥類、哺乳類動物之間具有較高的保守性。

圖2 斜帶石斑魚TauT氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of TauT based on amino acid sequences in grouper and other species

2.4 斜帶石斑魚正常組織TauT mRNA表達的差異

由圖3可知，TauT基因在所有測組織中均有表達，表達水平差異明顯。TauT基因在9個組織中的相對表達量由高至低依次為：肝臟、心臟、腦、腎臟、鰓、脾臟、腸道、肌肉、脂肪。

2.5 ?；撬崽幚砗笮睅唪~TauT mRNA表達的差異

由表3可知，各實驗組斜帶石斑魚的增重率均隨著牛磺酸水平的增加呈先升高后降低的趨勢，?；撬崽砑恿?%（D3）組的增重率最高，其次為?；撬崽砑恿?.5%（D4）組，D3和D4組增重率顯著高于對照組（P＜0.05）。

表2 斜帶石斑魚TauT氨基酸序列的同源性分析Tab.2 Homology analysis of TauT amino acid sequences in grouper and other species

圖3 斜帶石斑魚TauT mRNA的組織表達水平Fig.3 Expression of TauT mRNA in various tissues in grouper

圖4 不同飼料?；撬崽砑铀较滦睅唪~心臟、肝臟、腦、肌肉、腸道TauT mRNA相對表達水平Fig.4 TauT mRNA expression in heart,liver,brain,muscle and intestine of the grouper fed the diets containing different levels of taurine

圖5 不同飼料?；撬崽砑铀较滦睅唪~鰓、脾臟、腎臟、脂肪TauT mRNA相對表達水平Fig.5 TauT mRNA expression in gill,spleen,kidney and fat tissue of the grouper fed the diets containing different levels of taurine

由圖4、圖5可知，斜帶石斑魚各個組織中TauT mRNA的相對表達量隨飼料牛磺酸水平的變化趨勢與增重率的變化趨勢基本一致，即斜帶石斑魚的增重率隨飼料?；撬崴降脑黾佣摺?/p>

表3 飼料中不同水平?；撬釋π睅唪~生長性能的影響Tab.3 Effect of dietary taurine level on the growth rate of grouper

3 討論

本文首次從斜帶石斑魚肝組織中分離和分析了TauT基因結(jié)構(gòu)功能區(qū)的保守序列全長。與已知魚類TauT基因一樣，斜帶石斑魚TauT跨膜區(qū)域為12個，在第三與第四跨膜區(qū)域之間有一個親水基環(huán)。這個環(huán)在N-179、N-187和N-190有三個潛在的N-糖基化位點。哺乳類動物TauT的跨膜區(qū)域為12個，其中在第三跨膜區(qū)域與第四跨膜區(qū)域之間存在著一個親水環(huán)，該環(huán)存在3個潛在的N-糖基化位點。這與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Na+和Cl-依賴性的轉(zhuǎn)運蛋白-神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運體的結(jié)構(gòu)具有極高的相似性。由此推測，斜帶石斑魚TauT是Na+、Cl-依賴型的轉(zhuǎn)運蛋白。哺乳動物的TauT對底物具有選擇性，如它只轉(zhuǎn)運牛磺酸、亞牛磺酸和β-丙氨酸等β-氨基酸類的氨基酸；與底物的親和力比較高；具有較高的離子依賴性[15]。本實驗通過基因克隆得到的TauT基因也具有這些特點，且分子量相近，由此可推斷斜帶石斑魚TauT也具有與底物結(jié)合的功能。

將斜帶石斑魚TauTORF區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列同鱸、斑馬魚、大西洋鮭、鯉、羅非魚、雞、人、牛、大鼠、小鼠的進行比對發(fā)現(xiàn)，不同物種TauTORF區(qū)域的核苷酸序列差異較大，但氨基酸序列卻具有極高的保守性。這是由于密碼子具有簡并性，進行沉默替代，所以氨基酸序列沒有發(fā)生變化。雖然基因中堿基序列不同，但沉默替代對編碼的蛋白及其功能無影響。但沉默現(xiàn)象有限制[16]，堿基序列的保守區(qū)也不隨機，推測這些保守區(qū)與保持基因的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。聚類分析與同源性分析顯示，斜帶石斑魚與魚類的親緣關(guān)系比較近，其中與鱸的親緣關(guān)系最近，但與哺乳類和鳥類的親緣關(guān)系較遠，這與傳統(tǒng)分類學(xué)一致。比對分析發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系較近的物種同源性較高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上比較靠近。

TauTmRNA在哺乳動物組織中都有表達，但其表達特征因物種而異。犬類心臟中，TauTmRNA的表達量最高[17]；牡蠣鰓、肝、腸等組織中TauTmRNA表達較高[18]；斑馬魚視網(wǎng)膜、心臟、大腦、腎臟中TauTmRNA的表達量高[19]；大西洋鮭的鰓、腎、心臟等組織中的TauT mRNA表達量較高[20]；鱸腦、鰓、腸、腎、脾的TauT mRNA表達量較高，而肌、心、肝、脂肪等組織表達量較低[21]；大菱鲆肝臟、腸道、肌肉、心臟中的TauT mRNA表達量較高，腦、眼睛、鰓和胃中表達量較低[22]。本實驗中，斜帶石斑魚TauT mRNA在肝臟、心臟、腦中表達量最高，腎臟、鰓、脾臟次之，腸道、肌肉、脂肪最低。不同組織TauT mRNA表達的差異反映了不同組織TauT參與?；撬徂D(zhuǎn)運的程度，可能與不同組織對牛磺酸的代謝強度和生理需要有關(guān)。

牛磺酸能夠促進TauT mRNA的表達。腹腔注射牛磺酸的鱸腸道、心臟、肝臟、鰓、腎臟等組織中TauTmRNA表達量顯著增高[21]。用牛磺酸處理高糖應(yīng)激大鼠，其Mǜller細胞中TauT mRNA表達量明顯增加[23]，但?；撬岬奶幚韯┝窟^高反而抑制了TauT mRNA的表達[22]。離體條件下，100mmol/L?；撬峤档土薔IH3T3細胞中TauT mRNA的表達水平[24,25]。增加原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中?；撬岷靠梢砸种聘邼B誘導(dǎo)的TauT mRNA表達[26]。本實驗中，斜帶石斑魚攝食缺乏?；撬岬娘暳虾螅琓auT mRNA表達水平明顯降低，1.0%?；撬犸暳辖M中TauT mRNA表達水平最高，1.5%?；撬犸暳辖M次之。這種變化趨勢與生長狀況一致，說明缺乏?；撬岵焕谛睅唪~幼魚的生長發(fā)育，需要從飼料供給較高含量的?；撬?，增加飼料中?；撬崴侥艽罅空T導(dǎo)TauT mRNA表達，以適應(yīng)?；撬岬拇罅啃枨?。敲除TauT基因的小鼠減重，組織內(nèi)的?；撬岷棵黠@下降，心臟檢測不出?；撬幔趋兰∨；撬岷肯陆盗?6%[27]。由此可知TauT對?；撬岬霓D(zhuǎn)運起關(guān)鍵作用，這也從側(cè)面反映了牛磺酸是通過TauT的跨膜運轉(zhuǎn)來實現(xiàn)其維持正常生長發(fā)育的功能。

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Cloning and Expression of Taurine Transporter（TauT）Gene and Effect Dietary Taurine Level on Expression of TauT Gene in Orange-spotted Grouper（Epinephelus coioides）

LI Jia-xu1,2，YE Ji-dan1,2
（1.Fisheries College,Jimei University,Xiamen 361021,China; 2.Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea,Ministry of Agriculture,Xiamen 361021,China）

Taurine transporter（TauT）is a key carrier in the transmembrane transport of taurine and plays an important role in growth, metabolism,and maturity in fish.The reverse transcription-ploymerase chain reaction（RT-PCR）and rapid amplification of cDNA ends（RACE）were applied to clone the sequence of TauT coding amino acids in orange-spotted grouper（Epinephelus coioides）with body weight of（12.85±0.46）g.The protein sequence of TauT appeared to have 1 881bp coding 626 amino acids with a molecular weight of 70 126.80 Da.The TauT was shown to share a high homology with other species of fish,and low homology with mammalian and birds through multi-sequence alignments and phylogenetic analysis.The grouper were fed the diets containing 0%,0.5%,1%and 1.5%taurine at water temperature of（27±2）℃for 28 d,and then the TauT mRNA was expressed in various tissues by using real-time PCR method.It was found that TauT mRNA was expressed in all the tissues detected,with higher expression levels in liver,heart and brain,followed by in kidney,gills and spleen,and the lower in gut,muscle and adipose tissues.The higher expression level of TauT mRNA was observed in the fish fed the diets containing taurine compared with that in the fish fed the basal diet.There was significantly higher expression level of TauT mRNA in the fish fed diets containing 1.0%and 1.5%taurine than that in fish fed 0.5%taurine diet. The findings indicate that dietary taurine supplementation could improve the TauT mRNA expression in tissues of orange-spotted grouper.

Epinephelus coioides;taurine transporter;homology analysis;gene expression

S917.4

A

1005-3832（2016）05-0048-07

2016-05-13

國家自然科學(xué)基金（31372546）.

李家旭（1989-），男，碩士研究生，從事動物營養(yǎng)與飼料研究.E-mail:973464720@qq.com

葉繼丹（1966-），研究員.E-mail:yjdwk@sina.com