王懿崢，陳揚，俞立?

①清華大學生命科學學院PTN項目，北京 100084；②清華大學-北京大學生命科學聯(lián)合中心，清華大學生命科學學院生物膜與膜生物工程國家重點實驗室，北京 100084

細胞自噬研究概覽

王懿崢①②，陳揚②，俞立②?

①清華大學生命科學學院PTN項目，北京 100084；②清華大學-北京大學生命科學聯(lián)合中心，清華大學生命科學學院生物膜與膜生物工程國家重點實驗室，北京 100084

自噬(autophagy)是一種細胞通過溶酶體或液泡(酵母)，將受損的或多余的細胞組分降解形成生物小分子的細胞代謝過程，在真核生物中十分保守，而其正常與否也與人類的身體健康密切相關。在距Christian de Duve發(fā)現(xiàn)溶酶體并提出自噬這個概念50多年后，日本分子細胞生物學家大隅良典因對自噬機制的闡明做出的重大貢獻而獲得了2016年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。本文旨在回顧自Christian de Duve發(fā)現(xiàn)溶酶體至今自噬領域的發(fā)展歷程，并介紹中國的研究現(xiàn)狀。

自噬；研究史；大隅良典

2016年，日本科學家大隅良典(日文：おおすみよしのり，英文：Yoshinori Ohsumi)因在細胞自噬機制研究方面做出的重大貢獻獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎[1]。自噬這一概念，最早是由溶酶體的發(fā)現(xiàn)者、著名的細胞生物學家Christian de Duve在1963年提出的。本文回顧了自發(fā)現(xiàn)溶酶體至今自噬領域的發(fā)展歷程，并介紹國內的研究現(xiàn)狀。

1 什么是自噬

對細胞來說，對環(huán)境中的營養(yǎng)水平進行響應，并充分利用胞內物質與能源是一門“必修課”，而自噬就是其中一種手段。自噬是一種介由溶酶體或液泡(酵母)而進行的具有或非選擇性的細胞組分降解，產生能量或生物小分子的細胞生理過程，并在真核生物中具有很高的保守性。自噬一般被分為三種類型：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。微自噬通過直接的溶酶體膜或液泡膜內陷或突出，進而吞食部分胞質；而巨自噬則是通過生成一種獨立的雙層膜結構——自噬體(autophagosome)包被胞質組分并運至溶酶體或液泡；CMA則是介由分子伴侶進入溶酶體[2]。

自噬還可以根據(jù)其是否選擇性降解某些底物分為選擇性自噬(selective autophagy)和非選擇性自噬(non-selective autophagy)。常見的選擇性自噬包括Cvt (cytoplasm to vacuole targeting)通路、過氧化物酶體自噬(pexophagy)、內質網(wǎng)自噬(ER phagy)及異體吞噬(xenophagy)等等[3]。

2 自噬的發(fā)現(xiàn)和提出

作為細胞“消化器官”的溶酶體，是在20世紀50年代被發(fā)現(xiàn)的。

1955年，比利時生物學家Christian de Duve等[4]在將大鼠肝臟細胞裂解物多重離心之后所獲的沉淀進行了一系列的酶學檢測，發(fā)現(xiàn)其中含有酸性磷酸酶、核酸酶以及β-葡萄糖醛酸苷酶等水解酶。因此，他根據(jù)其功能特點，將這一新發(fā)現(xiàn)的細胞器命名為“溶酶體(lysosome)”，意為“降解體(digest body)”。

電鏡的發(fā)展與應用極大地促進了人們對溶酶體的認識和理解。在1956年，Alex B. Novikoff等[5]通過電鏡不僅觀察了純化所得溶酶體的結構，而且還在大鼠肝臟組織切片中觀察到了類似的結構，進一步說明了溶酶體是一類真實存在的細胞器。

對溶酶體的形態(tài)學研究也促進了對其功能的理解。相關學者先后在內吞作用活躍的巨噬細胞和白細胞中發(fā)現(xiàn)了大量的溶酶體，并發(fā)現(xiàn)內吞形成的囊泡終究會與溶酶體融合[6]。

對溶酶體深入的研究也促使了自噬現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)。細胞外的物質可以通過內吞被細胞攝取并通過溶酶體被降解，而胞內組分降解的細節(jié)在當時就鮮為人知[7]。

1957年，S. L. Clark[8]在觀察新生小鼠腎臟細胞分化時，意外地觀察到了在細胞質中存在著一些無固定形狀的、包裹著一些致密的片層結構，甚至是線粒體的囊泡結構。

1962年，T. P. Ashford和K. R. Porter[9]在用胰高血糖素處理大鼠肝臟后發(fā)現(xiàn)在肝臟細胞中產生了大量包裹著細胞組分的溶酶體。他們還發(fā)現(xiàn)線粒體更容易被溶酶體包裹。

基于大量的觀察和形態(tài)學研究，C. de Duve在1963年提出了“自噬(autophagy)”的概念[10]。

1968年，A. U. Arstila和B. F. Trump[11]通過利用胰高血糖素誘導自噬，發(fā)現(xiàn)了一種包被著細胞組分卻無水解酶的雙層膜結構，即自噬體(autophagosome)和另一種含有多種水解酶的單層膜結構，即自噬溶酶體(autophagolysosome)。通過總結前人和自己所觀察到的現(xiàn)象，他們繪制出的自噬相關囊泡的形成和互作的示意圖，使得人們對自噬的了解更加深入。

3 自噬的誘導和抑制

對自噬進行系統(tǒng)的研究，其誘導及抑制系統(tǒng)的建立在當時則顯得格外重要。

上文中所提及的T. P. Ashford和K. R. Porter在1962年的工作中，利用胰高血糖素來誘導大鼠肝臟細胞產生了大量的溶酶體。

1967年，R. L. Deter及C. de Duve[12]受到Ashford和Porter工作的啟發(fā)，發(fā)現(xiàn)胰高血糖素可以誘導肝臟細胞發(fā)生自噬，為后續(xù)對自噬生理功能等方面的研究提供了很好的模型。

1976年，G. E. Mortimore和W. F. Ward[13]在研究大鼠肝臟蛋白質降解機理的過程中發(fā)現(xiàn)，氨基酸水平參與調解該過程。當氨基酸濃度較高時，蛋白質降解則受到抑制；反之，則促進蛋白質降解。

1980年，P. O. Seglen等[14]重復了G. E. Mortimore和W. F. Ward的工作，并發(fā)現(xiàn)亮氨酸和天冬酰胺共同使用時對自噬的抑制效果最佳。

1982年，P. O. Seglen和P. B. Gordon[15]發(fā)現(xiàn)3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)對細胞內源蛋白的降解有明顯的抑制作用，并通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞內自噬體的形成也受到了明顯抑制。因此，他們認為3-MA是一種自噬抑制劑，而3-MA本身也成為一種至今仍被廣泛使用的自噬抑制劑。

氨基酸饑餓和3-MA的發(fā)現(xiàn)使得科學家們找到了誘導自噬和抑制自噬的方式，使進一步研究自噬的機制和生理功能變成了可能。

4 APG基因的發(fā)現(xiàn)

如果想對某一生理過程進行研究，只停留在觀察現(xiàn)象是遠遠不夠的，所以當時的學者們開始了對自噬基因層面的研究。但是很明顯，較長的生命周期和較差的繁育能力，使得動物模型并不是進行遺傳篩選的最佳選擇。

日本學者大隅良典選擇利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)這一模式生物進行遺傳篩選，以期篩選到一系列自噬缺陷菌株。釀酒酵母的細胞質中存在著一個巨大的單層膜囊泡結構，即液泡(vacuole)，其中富含氨基酸和各種離子等營養(yǎng)物質，而且還含有多種水解酶，因此一般將其等同于哺乳動物細胞的溶酶體。

1992年，大隅良典實驗室的K. Takeshige等[16]發(fā)現(xiàn)缺乏蛋白酶A、B及羧肽酶Y的細胞在氮源或碳源饑餓之后，利用電鏡觀察到酵母液泡中有很多囊泡狀結構，即自噬小體(autophagic body，翻譯為自噬小體是以期與自噬體autophagosome區(qū)別開來)，且該現(xiàn)象可以通過普通的相差或Nomarsky顯微鏡直接觀察，這就為后續(xù)的遺傳篩選提供了一個很好的工具。其中pep4Δ菌株至今仍是研究自噬缺陷重要的工程菌之一。

1993年，M. Tsukada和Y. Ohsumi[17]利用上述現(xiàn)象進行了一系列的自噬缺陷突變菌株的篩選。他們采取了兩種方法：一是將誘變產生的菌株進行碳源饑餓再通過顯微鏡觀察；二是將誘變產生的菌株影印至含有焰紅染料B(phloxine B)的氮源饑餓平板上，挑選變?yōu)榧t色的菌株再被含有苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，PMSF可以使野生型菌株模擬出蛋白酶缺陷型菌株在饑餓之后的液泡中富集自噬小體的表型)的無氮源培養(yǎng)基饑餓后通過顯微鏡觀察。兩者皆是以液泡中未觀察到自噬小體為目標菌株。

通過上述的方法，他們首先篩得了兩個突變菌株，發(fā)現(xiàn)這兩個突變是位于同一個等位基因，并將該基因位點命名為APG1(AutoPhaGy 1，即現(xiàn)在的ATG1)。利用這種方法，他們一共找到了15個基因，并將它們依次名命名為APG1～APG15。

經過進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些基因缺陷型的菌株在生長增殖方面并未表現(xiàn)出明顯的缺陷，但在氮源饑餓之后它們的生存能力受到了巨大影響。這也是方法二中初篩的原理。

1997年，大隅良典實驗室的A. Matsuura等[18]發(fā)現(xiàn)APG1編碼一種新型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，且其激酶活性是自噬所必需的。

毋庸置疑，自噬相關基因的發(fā)現(xiàn)也極大地推進了自噬機制在分子水平上的研究?？梢哉f，沒有大隅良典的工作，自噬領域就不可能發(fā)展到今天的水平。

5 Cvt通路的發(fā)現(xiàn)

幾乎與大隅良典同時(1992年)，在太平洋彼岸美國的D. J. Klionsky等[19]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母基因APE1所編碼的氨基肽酶I (aminopeptidase I， API)前體必須被送至液泡，且該過程依賴于基因PEP4。

1995年，D. J. Klionsky實驗室的T. M. Harding等[20]利用遺傳誘變篩選的方法，找到了一系列使得API前體(pro-API)無法被轉化為成熟的API蛋白(mAPI)的基因，并將其命名為CVT1至CVT8(其中CVT4及CVT8被認為分別是已被發(fā)現(xiàn)的VPS家族的VPS39及VPS41)，而該通路則被命名為細胞質至液泡的尋靶[21](cytoplasm to vacuole targeting，Cvt)通路。

先于細胞質中形成的囊泡定向與液泡融合，其內容物可以被液泡中的蛋白酶降解。Cvt通路的這一特點，讓D. J. Klionsky意識到，Cvt通路可能與自噬有關。但同時他們也意識到，自噬發(fā)生于營養(yǎng)匱乏時，而Cvt通路大多是在營養(yǎng)充足的情況下進行，所以兩者也存在著固有的不同。

于是殊途同歸，在1997年，D. J. Klionsky與大隅良典實驗室[22]合作闡明了Cvt通路和經典自噬的區(qū)別與聯(lián)系。

2003年，為了自噬領域更好地進行研究交流和討論，D. J. Klionsky、大隅良典及其他自噬領域的同仁[23]聯(lián)合發(fā)文，統(tǒng)一了自噬相關基因在釀酒酵母中的命名方法，即ATG相關基因(AuTophaGy related genes)。這一次命名的統(tǒng)一不僅總結了過去十幾年對自噬相關基因的一系列研究工作，還為接下來的研究消弭了很多不必要的麻煩，從此自噬領域進入了高速發(fā)展時代。

6 自噬機制的研究時代

在大量與自噬相關的基因被鑒定之后，科學家們十分急迫地想了解，這些基因與基因、基因與自噬之間到底是一種怎樣的關系，于是自噬機制的研究如火如荼地進行開來。這其中最有名的莫過于兩大類泛素化系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)。

首先是Atg12p-Atg5p類泛素化系統(tǒng)。

1998年，大隅良典實驗室的N. Mizushima等[25-26]，在利用蛋白質免疫印跡手段檢測帶有HA標簽的Atg12p(當時還叫Apg12p，31.0～32.5 kD)時，發(fā)現(xiàn)在約70 kD的位置上多出來了一條帶。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這是由于Atg5p與Atg12p結合形成類泛素化系統(tǒng)穩(wěn)定的結構而導致的。爾后通過查詢數(shù)據(jù)庫，在人類細胞系中找到了Atg12p的人類同源物hAtg12，發(fā)現(xiàn)在人類細胞中也存在著同樣的系統(tǒng)。

1999年，N. Mizushima等[27]又發(fā)現(xiàn)Atg12p-Atg5p的功能與Atg16p息息相關。Atg16p在形成Atg12p-Atg5p-Atg16p異源多聚體時行使連接功能；2001年，N. Mizushima等[28]發(fā)現(xiàn)Atg5p定位于隔離膜(isolation membrane)，且其與Atg12p結合的有無并不影響其定位；N. Mizushima等[29]又于2003年在小鼠中鑒定了與Atg5相互作用、與酵母Atg16p同源的Atg16L。

其次便是Atg8p-PE類泛素化系統(tǒng)。

1999年，T. Kirisako等[30]發(fā)現(xiàn)自噬發(fā)生后Atg8會與隔離膜緊密相連，且該過程依賴于Atg4；緊接著2000年，T. Kirisako等[31]發(fā)現(xiàn)通過Atg4p切去Atg8p的甘氨酸殘基后，再經E1樣酶Atg7p、E2樣酶Atg3p形成Atg8p-X復合物；同年，Y. Ichimura等[32]發(fā)現(xiàn)所謂的X是磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)。

2000年，Y. Kabeya等[33]發(fā)現(xiàn)酵母Atg8p哺乳細胞同源物LC3，在被翻譯后加工為LC3-II后，會定位在自噬體及自噬溶酶體上。2004年，N. Mizushima等[34]將LC3/Atg8當作一種標記應用于觀察小鼠不同組織細胞在不同營養(yǎng)條件下的自噬情況。

與此同時還有Atg1-Atg13、PI3P復合體等自噬調節(jié)機制的發(fā)現(xiàn)，使得人們對自噬的理解更加深入。

7 疾病時代

自噬的分子機制被逐漸闡明的同時，有一波科學家開始將目光有意無意地轉移到自噬與人類疾病的關系上來，從而開啟了自噬的“疾病時代”。

早在1999年，B. Levine實驗室的X. H. Liang等[35]就發(fā)現(xiàn)酵母Atg6p的哺乳同源物Beclin 1可以抑制人類乳腺癌細胞系MCF7的增殖和在裸鼠中的成瘤過程。

2000年，A. Petiot等[36]在HT-29細胞中發(fā)現(xiàn)，PI3K直接參與細胞自噬過程；2001年，S. Arico等[37]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制因子PTEN通過抑制PI3K/蛋白激酶B通路來正向調控自噬；2001年，K. Podsypanina等[38]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素的類似物可以通過抑制mTOR的活性來減緩PTEN缺陷小鼠體內腫瘤的形成。也正因此，在2002年時，雷帕霉素的類似物CCI-779和RAD-001被運用于臨床試驗[39-40]。

2003年，B. Levine實驗室的X. Qu等[41]進一步發(fā)現(xiàn)beclin 1的雜合敲除即可增加小鼠體內形成惡性腫瘤的幾率，促進細胞增殖。所以他們認為自噬可能調控腫瘤的形成。

2006年，N. Mizushima實驗室的T. Hara等[42]發(fā)現(xiàn)Atg5敲除小鼠神經細胞在發(fā)育過程中存在漸進的損傷，并在其神經元的細胞質中發(fā)現(xiàn)內含體的積累。因此他們推斷，自噬可能通過降解不正常蛋白，避免其積累來保證神經細胞的正常發(fā)育。

除去對傳統(tǒng)自噬異常導致的疾病的研究，科學家們對選擇性自噬與疾病關系的研究也越發(fā)深入。p62及Tollip等一系列重要的適配蛋白就此被發(fā)現(xiàn)。

2007年，M. Komatsu等[43]發(fā)現(xiàn)p62參與調控內含體的形成，且敲除p62可以顯著緩解因自噬缺陷而導致的對肝細胞的損傷。所以自噬可能是通過調節(jié)p62的水平來調控內含體的形成。有趣的是，同年S. Pankiv等[44]發(fā)現(xiàn)p62不僅參與內含體的形成，還可以通過與泛素和LC3互作，將蛋白聚集體降解。

2014年，K. Lu等[44]在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了類似于哺乳細胞中的p62，通過與Atg8p及泛素互作，降解蛋白聚集體，卻不與p62同源的Cue5，并且在哺乳細胞中找到其同功同源物Tollip。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Tollip可以通過選擇性自噬降解富谷氨酰胺蛋白來避免亨廷頓癥(Huntington’s disease)。

自噬同人類健康和疾病之間極為密切的聯(lián)系，也讓人們開始認識到自噬其重要性。然而在用藥和監(jiān)控方面，自噬相關疾病的治療還任重而道遠[45]。

綜上所述，我們可以將大隅良典對于自噬領域的貢獻總結為以下三個方面：①發(fā)現(xiàn)了ATG系列基因，不僅闡釋了自噬的分子機制，還為科學研究提供了阻抑自噬的手段；②發(fā)明了一系列檢測自噬水平的技術手段，例如GFP-Atg8p剪切實驗及觀測GFP-Atg8p進入液泡的情況等等；③為自噬領域培養(yǎng)了一大批科學人才，包括發(fā)現(xiàn)了Atg5p-Atg12p類泛素化系統(tǒng)的N. Mizushima，發(fā)明了Pho8Δ60分析的T. Noda，以及發(fā)現(xiàn)自噬體標記蛋白LC3的T. Yoshimori等等。

8 自噬與中國

我國在自噬領域起步較晚，但經過多年的努力建設，我國的細胞自噬研究也已有長足發(fā)展，得到國際同行的廣泛關注和認可，在多個分領域已達到國際領先水平。

中國科學院生物物理研究所張宏研究員[46-49]鑒定了一系列多細胞生物特異的自噬新基因并闡明其作用機制，建立了以多細胞生物線蟲為模式生物研究發(fā)育過程中自噬活性調控機制的模型。浙江大學醫(yī)學院劉偉教授[50-52]致力于研究乙?；?去乙酰化對自噬的影響、能量脅迫誘導的新自噬通路的分子調控機制和生理意義。中國科學院動物研究所陳佺研究員[59-60]對線粒體選擇性自噬有深入的研究。清華大學生命科學學院劉玉樂教授[61-62]鑒定了植物新自噬通路——葉綠體自噬，并在自噬調控植物先天免疫分子機制研究中取得重要進展。北京大學基礎醫(yī)學院陳英玉教授[63-64]在新自噬分子的鑒定及其在腫瘤和自身免疫病中的作用研究中做出貢獻。上海交通大學生命科學技術學院謝志平研究員[65-66]致力于自噬早期事件的研究。中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所楊崇林教授[67]長期致力于溶酶體介導的蛋白質降解通路的調控機制研究，同時在實驗室中大力開展了自噬晚期溶酶體事件的研究。上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所胡榮貴研究員[68]注重蛋白質穩(wěn)態(tài)平衡的研究，并尤其偏重于蛋白質降解途徑中自噬途徑的研究。我們實驗室發(fā)現(xiàn)自噬性溶酶體再生這一標志自噬末期的細胞生物學過程，對其進行了系統(tǒng)的研究(autophagic lysosome reformation, ALR)[53-58]，并利用酵母對自噬的調控進行了深入的研究。

同時，多名中國科學家在Gordon Conference、Cold Spring Harbor、the Zing Conference、ISA、Keystone、EMBO Workshop等國際著名會議中擔任主席、分會主席或者受邀發(fā)表報告，影響力已不容小覷。俞立教授受邀作為2014年Keystone會議、2016年冷泉港亞洲會議的共同組織者，并被選為2020年Gordon國際自噬會議的主席。張宏研究員作為主席組織召開了2015年第七屆國際細胞自噬會議。目前國內已經形成了以中年科學家為核心、青年科學家為骨干的研究隊伍，并逐步吸引領域相關人才的加入，具有一定的研究規(guī)模，成功搭建了重要的實驗體系和實驗平臺，建立了多種研究模型。此外還有一批海外歸國的青年科學家加入了自噬的研究隊伍。因此，當前正是中國科學家對于自噬在多細胞生物中應對多種脅迫條件的功能和生理學意義開展研究的關鍵時機。

(2016年12月6日收稿)

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(編輯：段艷芳)

Brief history of autophagy research

WANG Yizheng①②, CHEN Yang②, YU Li②
①PTN Program, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China; ②State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Tsinghua University-Peking University Joint Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Autophagy is an evolutionarily conserved, lysosome based degradation process which plays important roles in various physiopathological conditions. Since Christian de Duve discovered lysosome, it has takenfour decadesfor autophagy researchers to reveal the basic mechanisms of autophagy. In 2016, Japanese biologist Yoshinori Ohsumi was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine, for his discoveries of mechanisms for autophagy. In this review, wesummarized the key events in the development of autophagy research.

autophagy, brief history, Yoshinori Ohsumi

10.3969/j.issn.0253-9608.2016.06.003

?通信作者，國家杰出青年科學基金獲得者，主要研究新細胞器遷移體(migrasome)的機制與功能、自吞噬在細胞及分子水平上的調控機制。E-mail: liyulab@mail.tsinghua.edu.cn