羅岸

摘要：在煙草合子中克隆到1種新型的未知功能基因NtZE583，編碼包含有91個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。生物信息學(xué)分析顯示：該蛋白的N端含有1段疏水性信號(hào)肽，但在其他物種中沒有發(fā)現(xiàn)同類蛋白。NtZE583-綠色熒光蛋白（NtZE583-GFP）融合蛋白亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白可能存在于液泡中。利用染色體步移技術(shù)獲得該基因5′端上游3 866 bp的側(cè)翼序列（啟動(dòng)子和5′UTR），經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因在煙草早期胚胎發(fā)生中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草；合子；液泡；基因克??；信號(hào)肽

中圖分類號(hào)： S572.01；Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0065-04

被子植物的受精過程被稱為雙受精，即來自同一花粉的2個(gè)精子同時(shí)進(jìn)入胚囊，1個(gè)與卵細(xì)胞結(jié)合形成二倍體的合子，另2個(gè)與中央細(xì)胞結(jié)合形成三倍體的胚乳母細(xì)胞。受精完成后，胚胎逐漸形成基本的形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)[1]，而胚乳則在此過程中扮演支持者的角色[2-3]。

對(duì)于受精和早期胚胎發(fā)生過程的分子機(jī)制在動(dòng)物中研究得比較深入，但是在植物中由于技術(shù)手段的限制導(dǎo)致對(duì)這方面的認(rèn)識(shí)一直有許多空白。因?yàn)橹参锏氖芫团咛グl(fā)生過程都存在于深埋在植物孢子體內(nèi)的胚囊中，所以很難對(duì)整個(gè)過程直接進(jìn)行觀察并了解背后的分子機(jī)制。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已能獲得玉米、擬南芥、大米、大麥等一些植物的配子、合子和早期胚胎；此外，這些植物中與生殖發(fā)育息息相關(guān)的細(xì)胞cDNA文庫、轉(zhuǎn)錄譜等也已陸續(xù)獲得[4-7]。這些進(jìn)展對(duì)于研究植物的受精和胚胎發(fā)生過程起到了推動(dòng)作用。

為了探索受精和早期胚胎發(fā)生的分子機(jī)制，特別是早期胚胎發(fā)生中的表觀調(diào)控機(jī)制、合子不等分裂、細(xì)胞間通信等重大問題，筆者所在實(shí)驗(yàn)室用前期建立的胚胎分離技術(shù)[8-9]和SMARTTM cDNA library construction試劑盒構(gòu)建了煙草合子和卵細(xì)胞的cDNA差減文庫，通過篩選獲得了許多在合子時(shí)期特異表達(dá)的基因[10]。對(duì)其中1個(gè)具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的未知基因NtZE583進(jìn)行克隆和染色體步移，獲得了其完整CDS序列和有活性的5′側(cè)翼調(diào)控序列，為進(jìn)一步利用基因敲除和過表達(dá)技術(shù)來研究其在煙草早期胚胎發(fā)育中的作用打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白表達(dá)載體，GFP核定位表達(dá)載體在pART27載體上改造而成，由武漢大學(xué)彭雄波副教授提供。大腸桿菌DH5α感受態(tài)為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2植物材料試驗(yàn)材料為野生型煙草（Nicotiana tabacum var. SR1），種植于長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院所屬溫室內(nèi)，室溫25 ℃，光照時(shí)間16 h。

1.1.3主要試劑普通DNA片段回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）；DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN公司）；Universal Genome Walker Kit（Clontech公司）；DNA聚合酶Ex Taq（TaKaRa公司）；DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerasehe、限制性內(nèi)切酶（NEB公司）；T4 DNA lignase（Fermentas公司）；Dynalbeads mRNA DIRECT Micro Kit（Life technologies公司）；SMARTerPico PCR cDNA Synthesis Kit（Life technologies公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1煙草genome walking文庫的構(gòu)建和NtZE583基因5′ 側(cè)翼區(qū)的克隆取煙草幼葉，按照DNeasy Plant Mini試劑盒的要求提取DNA。用UniversalGenomeWalker試劑盒構(gòu)建genome walking 文庫，檢測(cè)合格后按照試劑盒要求設(shè)計(jì)GSP引物。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒要求，引物退火溫度靈活掌握，得到目的片段后送樣測(cè)序，引物序列詳見表1。

1.2.2煙草合子的分離與少量細(xì)胞RT-PCR用酶解-研磨法分離得到50個(gè)煙草合子[8-9]。按照Dynalbeads mRNA DIRECT Micro試劑盒的說明分離出合子的mRNA，并使用SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis試劑盒制成合子cDNA庫。在已知EST序列2端設(shè)計(jì)檢測(cè)引物擴(kuò)增 NtZE583 基因CDS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)正確后送樣測(cè)序，引物序列詳見表2。

1.2.3NtZE583-EGFP融合蛋白和EGFP核定位表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)已知序列，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增NtZE583基因的5′ 側(cè)翼區(qū)和CDS的引物，并在5′端添加酶切位點(diǎn)，引物序列見表3。用CDS-F2/CDS-R2引物，在煙草合子cDNA庫中擴(kuò)增CDS序列；用PRO-F/PRO-R在煙草基因組中擴(kuò)增NtZE583基因側(cè)翼序列（啟動(dòng)子和5′UTR）。對(duì)目的條帶回收后進(jìn)行雙酶切，并分別連入NtZE583-GFP融合蛋白表達(dá)載體、GFP核定位表達(dá)載體。

表3載體構(gòu)建所需引物

1.2.4NtZE583-GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位和NtZE583啟動(dòng)子活性的觀察應(yīng)用基因槍法將構(gòu)建好的NtZE583-GFP融合蛋白表達(dá)載體和EGFP核定位表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用普通熒光顯微鏡觀察。

1.2.5生物信息學(xué)分析用Omiga分析EST序列的開放閱讀框。用Protparam、ProtScale軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸組成和理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)，并通過SOPMA軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。分別用PSORT、SignalP軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽。

2結(jié)果與分析

2.1煙草早期胚胎的分離

植物的胚胎發(fā)育過程發(fā)生在母體組織中。由于母本組織的干擾，通常難以有效地獲取正在發(fā)育的胚胎細(xì)胞。目前通過酶解和顯微操作已經(jīng)能夠精確地分離出煙草SR1胚珠中合子發(fā)育時(shí)期的胚囊（圖1-A）。合子為胚囊細(xì)胞所包裹，必須進(jìn)行2次酶解和顯微操作才能獲得未附帶母體組織的完整的合子（圖1-B）。圖1結(jié)果顯示：經(jīng)過酶解和顯微操作分離后的合子形態(tài)正常，背景清晰無雜質(zhì)，這說明分離的合子狀態(tài)良好且無母體組織污染，可以用于后續(xù)少量細(xì)胞mRNA的提取和cDNA庫的制作。

2.2NtZE583基因在合子中的檢測(cè)

根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室之前獲得的煙草合子cDNA 文庫信息，已知煙草合子中存在NtZE583基因的表達(dá)。NtZE583基因EST序列長(zhǎng)度為449 bp，Omega軟件分析顯示，該基因擁有1個(gè)273 bp的開放閱讀框，可以在合子cDNA庫中得到擴(kuò)增（圖2）。經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，尚無類似基因存在于其他物種中，表明NtZE583基因?qū)儆?個(gè)未知功能的、在早期胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)的新型基因。

2.3NtZE583蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

運(yùn)用軟件對(duì)NtZE583蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：NtZE583蛋白的分子量為9.785 3 ku，理論等電點(diǎn)為 8.46，屬于堿性蛋白。該蛋白多肽鏈包含91個(gè)氨基酸殘基，含18 種基本氨基酸類型，不含組氨酸、色氨酸，其中絲氨酸含量最高，占16.5%。氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明：NtZE583蛋白擁有8個(gè)正電荷殘基、5個(gè)負(fù)電荷殘基，該蛋白脂肪系數(shù)為72.86，不穩(wěn)定性指數(shù)為50.07，平均總疏水性為0.286，預(yù)測(cè)為疏水性蛋白，且不太穩(wěn)定（表4）。

2.4NtZE583蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)多肽鏈自身通過氫鍵沿一定方向盤繞、折疊而形成的構(gòu)象稱為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角等屬于蛋白質(zhì)的基本二級(jí)結(jié)構(gòu)。正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于蛋白質(zhì)正常履表4NtZE583基因編碼的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果行其在細(xì)胞生命活動(dòng)中的功能。 軟件分析顯示，NtZE583蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有3種形式，分別為α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈，分別占18.68%、52.75%、28.57%）。圖3結(jié)果顯示，無規(guī)則卷曲這類二級(jí)結(jié)構(gòu)在NtZE583蛋白中最多，α-螺旋主要集中在蛋白的N端，而延伸鏈則在蛋白中零星分布（表5、圖3）。

2.5NtZE583蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)與蛋白亞細(xì)胞定位的分析

用Psort軟件對(duì)NtZE583蛋白亞細(xì)胞分布進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)最可能分布在膜外。同時(shí)用ProtScale軟件預(yù)測(cè)NtZE583蛋白N端的氨基酸發(fā)現(xiàn)，其具有較強(qiáng)的疏水性；用SignalP軟件預(yù)測(cè)NtZE583蛋白發(fā)現(xiàn)可能存在信號(hào)肽，并在第24、第25個(gè)氨基酸之間剪切（圖4）。為了進(jìn)一步分析NtZE583蛋白的亞細(xì)胞定位，采用融合蛋白載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞。由圖5可以看出：35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP蛋白在細(xì)胞中均勻分布，而35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的NtZE583-GFP融合蛋白則主要分布在細(xì)胞質(zhì)的液泡中，暗示NtZE583蛋白的亞細(xì)胞定位受其N端的信號(hào)肽控制。

2.6NtZE583基因的5′側(cè)翼序列在早期胚胎時(shí)期的活性

以EST序列為基礎(chǔ)，通過染色體步移技術(shù)共獲得NtZE583基因起始密碼子ATG前共3 866 bp的側(cè)翼序列。為驗(yàn)證其啟動(dòng)活性，擴(kuò)增了其中的2 725 bp（包括部分啟動(dòng)子、全部5′UTR序列）接入GFP核定位載體，采用基因槍將載體注射入洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行觀察。熒光顯微鏡中可以看到，洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中有清晰可辨的綠色熒光（圖6），表明所獲基因的5′側(cè)翼序列確實(shí)具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。

3討論

在煙草合子中表達(dá)的NtZE583基因含有273 bp的CDS區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)作為一種未知功能的新型蛋白，在NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的雙子葉和單子葉植物的基因信息中均未發(fā)現(xiàn)，其可能在煙草合子的發(fā)育過程中起著某種獨(dú)特的作用。對(duì)新獲得的NtZE583蛋白序列進(jìn)行分析表明，該蛋白具有信號(hào)肽；將NtZE583蛋白與GFP蛋白融合后在洋蔥表皮細(xì)胞中觀察其亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)它極有可能定位于細(xì)胞的液泡中。

植物細(xì)胞相對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞而言，普遍含有液泡這一特殊的細(xì)胞器[11-13]。液泡由單層質(zhì)膜包圍而成并充滿液體，與植物細(xì)胞的各種重要的生命活動(dòng)息息相關(guān)，如參與細(xì)胞滲透壓和膨壓的維持與調(diào)節(jié)、幫助穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)pH值、消除由某些有毒物質(zhì)導(dǎo)致的毒害作用、存儲(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)及其多種代謝產(chǎn)物、保證細(xì)胞生物合成原料的穩(wěn)定供應(yīng)等。

NtZE583基因的發(fā)現(xiàn)表明，在煙草合子的發(fā)育過程中有一種獨(dú)特的未知功能的蛋白存在于液泡中并發(fā)揮了重要作用。本研究利用染色體步移技術(shù)對(duì)NtZE583基因的5′側(cè)翼序列進(jìn)行了克隆，將包括啟動(dòng)子、5′UTR區(qū)的序列連接GFP后瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，能觀察到極強(qiáng)的綠色熒光。說明獲得的表達(dá)調(diào)控序列具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，為今后使用RNA干擾（RNAi）和過表達(dá)等基因功能分析手段對(duì)NtZE583基因在合子發(fā)育中的功能進(jìn)行研究提供了幫助，將豐富我們對(duì)植物早期胚胎發(fā)生過程中的分子調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

4結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆了煙草合子表達(dá)基因NtZE583，并獲得了具有啟動(dòng)子活性的5′側(cè)翼序列，為闡明NtZE583基因參與早期胚胎發(fā)生的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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